布洛芬抑制博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠一氧化氮生成的機制研究

王春雷，張燁，蔡開霞，王斯琪

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院老年病科，沈陽 110001）

氧化應激反應在肺纖維化的發(fā)病中起重要作用，其中核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）作為重要的細胞因子、黏附分子及炎性介質的轉錄因子，參與急性肺損傷的發(fā)?。?］。研究表明，肺纖維化中可見 NF-κB 的激活［2，3］。NF-κB 在內、外源性刺激，如射線、化療藥物、活性氧等的參與下，作用于肺巨噬細胞、支氣管肺泡上皮細胞等細胞后誘導性一氧化氮合成酶 （inducible nitric oxide synthase，iNOS）mRNA的表達，催化L-精氨酸產生過量一氧化氮（nitric oxide，NO）。iNOS和NO對肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展起重要作用［4，5］。我們的前期研究證實：博萊霉素引起的肺纖維化中，NO表達明顯增加，而布洛芬可抑制NO的表達，但其機制并不清楚。本研究擬探討博萊霉素是否可引起小鼠肺組織中iNOS和NF-κB上調及布洛芬對其產生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級雄性C57BL/6小鼠購自中國醫(yī)科大學實驗動物中心；博萊霉素購自哈爾濱博萊制藥有限公司；布洛芬購自煙臺第二制藥廠；NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所；NF-κB p50和p65多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；抗iNOS抗體購自美國R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及分組：取健康雄性C57BL/6小鼠 50只，隨機分為對照組（A）、模型組（B）、布洛芬 5 mg/kg（C）、10 mg/kg（D）、20 mg/kg（E）治療組，每組10只。10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉小鼠后，用1 mL注射器吸取博萊霉素溶液（生理鹽水配制3 mg/kg）氣管快速注射后，將小鼠垂直放置，旋轉3周，使博萊霉素均勻分布于肺部，縫合傷口，讓小鼠自然清醒。A組注射同容積的生理鹽水。C、D、E組注射博萊霉素1 d后，每天分別腹腔注射相應劑量的布洛芬（生理鹽水配制）進行治療，連續(xù)28 d。

1.2.2 血清NO含量檢測：實驗結束后，處死小鼠（每組各5只），腹主動脈采血，4 000 r/min離心10 min，收集血清，用NO化學法試劑盒檢測小鼠血清中NO含量。

1.2.3 肺組織NF-κB的檢測：實驗結束后，處死小鼠（每組各5只）。取支氣管、部分肺組織凍存于-80℃?zhèn)溆?。采?步法免疫組織化學法檢測：用3%H2O2孵育肺組織超薄切片10 min。加一抗（1︰50兔抗NF-κB p65亞單位的抗體和1︰50兔抗NF-κB p50亞單位的抗體），室溫孵育2 h，PBS沖洗，滴加試劑1，室溫孵育20 min；PBS液沖洗，滴加二抗，室溫孵育20 min。以細胞核染成棕褐色者為陽性細胞。每張病理切片隨機選取10個高倍視野，計數其中陽性細胞數，計算陽性細胞占細胞總數的百分比。

1.2.4 Western blot法檢測各組肺組織中iNOS蛋白表達水平：取各組小鼠肺組織，RIPA裂解液裂解組織，BCA法進行蛋白質濃度測定，取20 μg等量蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（12%SDS-PAGE），轉至PVDF膜，用5%蛋白液洗膜3次。用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗鼠單克隆抗體anti-iNOS（1︰800）和 β-actin（1︰1 500），4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1︰2 000）。ECL顯色，凝膠成像分析系統進行掃描。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組小鼠血清NO含量的比較

與對照組［（1.646±0.44）μmol/g］比較，模型組小鼠血清 NO 含量［（5.500±0.87）μmol/g］顯著增加（P<0.01）。布洛芬5 mg/kg治療組血清NO含量［（4.064±0.64）μmol/g］無明顯變化，而布洛芬 10 mg/kg治療組［（2.174±0.51）μmol/g］、20 mg/kg治療組［（1.927±0.35）μmol/g］血清 NO 含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），提示布洛芬可緩解肺纖維化所引起的NO增高。而且布洛芬20 mg/kg治療組的血清NO明顯低于5 mg/kg和10 mg/kg治療組，說明血清NO含量與布洛芬劑量有一定關系。相關分析顯示NO下降水平與布洛芬劑量呈負相關（y=-1.260 9x＋6.568 5，R2=0.932 7），具有統計學意義。

2.2 各組肺組織NF-κB含量的比較

如表1所示：與對照組比較，模型組肺組織NF-κB含量顯著增加（P<0.01）。布洛芬5 mg/kg治療組肺組織NF-κB含量無明顯變化，而布洛芬10 mg/kg和20 mg/kg治療組肺組織NF-κB含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），而且布洛芬20 mg/kg和10 mg/kg治療組的NF-κB明顯低于布洛芬5 mg/kg治療組。說明布洛芬抑制肺纖維化引起的NO增高與下調NF-κB 有關。

表1 各組肺組織NF-κB的比較（%）Tab.1 Comparison of NF-κB expression in the lung tissues from different groups（%）

2.3 肺組織中iNOS蛋白表達水平

Western blot結果（圖1）顯示：與正常對照組比較，模型組肺組織iNOS表達明顯增加（P<0.01），布洛芬5mg/kg治療組無明顯變化，而布洛芬10mg/kg、20 mg/kg治療組則明顯降低（P<0.05，P<0.01），且布洛芬20 mg/kg、10 mg/kg治療組iNOS明顯低于布洛芬5 mg/kg治療組。

3 討論

NO作為一種生物信使分子和細胞毒性效應分子，參與細胞內信號傳導，具有舒張動脈、降低血小板黏滯性和抗炎作用，但過量NO及其代謝產物則可導致機體損傷。研究表明，肺內NO的大量生成可能是促使肺纖維化形成的因素之一［4］，但其機制尚不清楚。本研究結果表明：博萊霉素誘導肺纖維化NF-κB表達上調，上調的NF-κB可能通過促進iNOS的轉錄和翻譯增加其蛋白的表達，從而促進NO的生成，而布洛芬則可明顯抑制上述反應，起到抑制纖維化的作用。

博萊霉素引起的鼠肺纖維化是公認的肺纖維化模型。目前認為，NO在肺間質纖維化的發(fā)生發(fā)展，特別是肺泡炎階段起重要作用［6，7］。其可能的機制為：（1）肺纖維化時產生的NO可擴張微血管，增加毛細血管后微靜脈的滲出，加重炎癥和組織水腫；（2）通過影響線粒體呼吸鏈復合物引起細胞毒作用［8］；（3）可能引起肺泡上皮細胞、肺泡巨噬細胞和肺成纖維細胞的增殖和調亡，參與肺纖維化的形成［9，10］。布洛芬可抑制NO的大量產生，抑制肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展。本研究結果發(fā)現布洛芬可通過抑制NF-κB的表達從而下調iNOS的表達水平，從而降低NO水平。本研究結果為臨床治療肺纖維化提供了一種新的治療途徑。

［1］An J，Chang L，Yulong S，et al.NF-κB induced the donor liver cold preservation related acute lung injury in rat liver transplantation model［J］.PLoS ONE，2011，6（9）：4960.

［2］Henno P，Maurey C，Danel C，et al.Pulmonary vascular dysfunction in end-stage cystic fibrosis：role of NF-κB and endothelin-1［J］.Eur Respir J，2009，34（6）：1329-1337.

［3］林箐，倪蓮芳，任雅麗，等.PPARγ和NF-κB在肺纖維化中的表達與意義［J］.北京大學學報（醫(yī)學版），2009，41（5）：545-547.

［4］Hofer M，Mueller L，Rechsteiner T，et al.Extended nitric oxide measurements in exhaled air of cystic fibrosis and healthy adults［J］.Lung，2009，187（1）：307-313.

［5］Naura AS，Zerfaoui M，Kim H，et al.Requirement for inducible nitric oxide synthase in chronic allergen exposure-induced pulmonary fibrosis but not inflammation ［J］.J Immunol，2010，185 （5）：3076-3085.

［6］孫玉敏，宋福成，陳曉玲.一氧化氮與肺纖維化的研究進展［J］.現代生物醫(yī)學進展，2006，6（9）：105-118.

［7］李偉峰，胡玉潔，袁偉鋒，等 氣管內滴入與霧化博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較研究［J］南方醫(yī)科大學學報，2012，32（2）：221-224.

［8］陳穎，代華平，王辰，等，特發(fā)性肺纖維化患者蛋白C系統的研究［J］.首都醫(yī)科大學學報，2006，27（1）：59-62.

［9］Nozaki Y，Hasegawa Y，Takeuchi A，et al.Nitric oxide as an inflammatory mediator of radiation pneumonitis in rats［J］.Am J Physiol，1997，16（3）：1651-1658.

［10］Barcas-Filho JV，Ferreira MA，Sesso A，et al.Evidence of type pneumocyte apoptosis in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis/usual interstitial pneumonia ［J］.J Clin Pathol，2004，54（2）：132-138.