9R穿膜肽可增強P53抗腫瘤效果

劉源，陳睿，張楠，葉賢龍，白銀，魏雨泉，任桂萍，李德山

東北農業(yè)大學生命科學學院 生物制藥教研室，黑龍江 哈爾濱 150030

p53基因是迄今發(fā)現與腫瘤相關性最高的基因，也是研究最為廣泛和系統的腫瘤抑制基因。人p53基因位于染色體 17p 13.1[1]區(qū)域，全長1 182 bp，由11個外顯子和10個內含子組成，編碼分子量為53 kDa的核內磷酸蛋白。正常的P53蛋白在體內有拮抗因環(huán)境壓力造成的 DNA損傷、維持基因組穩(wěn)定的作用；對于可修復損傷，P53調控細胞周期暫時的釋放，以便于有足夠的時間進行修復，進而重新進入正常的細胞周期[2-5]；相反，嚴重的或者不可修復的DNA損傷將導致細胞凋亡；P53還有抑制腫瘤血管生成等功能[6-10]。

細胞穿膜肽 (Cell-penetrating peptides，CPPs) 是一類能攜帶大分子物質進入細胞的短肽，其穿膜能力不依賴于經典的胞吞作用[11]。CPPs根據來源可以分為天然存在的和人工合成的兩種，天然的穿膜肽來源于天然蛋白質的多肽區(qū)域，主要負責將蛋白質向細胞內轉運，包括TAT-PTD[12-13]、Penetration和 VP22[14]。這些細胞穿膜肽均為帶有正電荷的、長短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基。利用這一特性，人工合成具有穿膜能力的多聚精氨酸和多聚賴氨酸的穿膜短肽，將生物分子帶入細胞內發(fā)生作用，是一種細胞滲透性多肽，具有廣泛的組織相容性、穩(wěn)定性、低毒性和低免疫原性、具有特異的組織及細胞遞送功能、可人工合成及程序簡單等[15]優(yōu)點。其中 9個精氨酸 (9R)是一類含有大量正電荷的堿性氨基酸，其作為一個蛋白轉運結構域來使用，它的堿性氨基酸殘基靠近細胞膜表面，然后CPPs發(fā)生旋轉使其疏水性氨基酸與細胞膜的疏水核心區(qū)相互作用，最后，細胞膜中的磷脂發(fā)生輕微斷裂，以使 CPPs穿透細胞膜[16]。

p53的基因產物是一種主要集中于核仁區(qū)、能與DNA特異結合、其活性受磷酸化調控且很容易降解，很容易因突變而喪失功能的蛋白。由于細胞膜的屏障，使得P53分子很難進入細胞，無法成為治療性蛋白藥物。本文將p53基因與穿膜肽9R基因融合于一體，表達可以穿透細胞膜P53融合蛋白，希望可以為腫瘤的生物治療提供一種新的策略。結果顯示帶有 9個精氨酸的CPPs-P53融合蛋白抑制腫瘤細胞生長的效果要明顯優(yōu)于沒有穿膜肽的P53。

1 材料與方法

1.1 材料

pHisSUMOexpression質粒、pHisSUMO-9R expression質粒、表達Escherichia coli菌株Rosetta (含DE3) 由本實驗室保存；人的外周血(志愿者提供)；HepG2細胞、U251細胞由本實驗室保存；Trizol購自Invitrogen公司；M-MLV逆轉錄酶購自 Promega公司；PMD-18T-simplevector購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶、限制性核酸內切酶購自NEB公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；新生牛血清購自Hyclone公司，Ni-NTA Agarose購自Sigma公司；蛋白分子量標準購自Fermentas公司；鼠抗人P53單克隆抗體 (D-07) 購自 DAKO公司；HRP標記的羊抗鼠IgG購自Bioscience公司；SUMO蛋白酶由本實驗室表達純化；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；質粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒均購自TIANGEN公司；所用的引物均由Invitrogen公司合成，引物見表1。

1.2 p53目的基因的獲得

采集志愿者的外周血，用Trizol提取人外周血的總RNA，并經RT-PCR擴增出目的片段，PCR反應體系為 1.0 μL cDNA 模板，2.5 μL 10×PCR緩沖液，2.0 μL dNTPs 混合液，0.5 μL rTaq聚合酶，2 μL PCR上下游引物 (10 mol/L)，滅菌三蒸水補足至25 μL。反應條件為：95 5 min℃ ；95 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃10 min。每次擴增均設由三蒸水代替模板的空白對照。產物經 PCR純化后，連接到 PMD-18-T-simple載體，經測序鑒定正確后，與NCBI上公布的人腫瘤蛋白p53(TP53) 基因的mRNA序列完全一致，分別用BsaⅠ和BamHⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，然后分別連接到pHisSUMO載體以及 pHisSUMO-9R載體并轉化至大腸桿菌Rosetta (DE3) 中進行表達。

1.3 目的蛋白的誘導表達

將轉入重組質粒 pHisSUMO-p53以及pHisSUMO-9R-p53的Rosetta (DE3) 劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)液中 (含100 mg/L氨芐青霉素) 振蕩培養(yǎng)過夜。將上述培養(yǎng)物按 1%的比例接種于LB培養(yǎng)液中 (含100 mg/L氨芐青霉素) 培養(yǎng)至OD值為0.3～0.4時，加入IPTG進行誘導表達。取不同IPTG濃度、不同誘導時間的誘導菌經超聲破碎后離心，將沉淀部分加入與上清相同體積的無菌純水，取菌體、上清部分及沉淀部分進行SDS-PAGE，檢測融合蛋白的表達情況。

1.4 CPPs-P53融合蛋白以及P53蛋白的純化

取pHisSUMO-p53以及pHisSUMO-9R-p53轉化菌大量誘導表達CPPs-P53及P53蛋白。誘導后的菌體用溶解緩沖液 (10 mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0)重懸后加入溶菌酶至終濃度為1 g/L，冰上放置30 min后超聲破碎，10 000×g、4 ℃離心 30 min，收集上清。上清利用AKTA purifier100系統經過HisTrapTM FF crude親和層析，用洗滌緩沖液 (20 mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0) 洗去雜蛋白后，再用洗脫緩沖液 (250 mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0) 洗脫，收集唯一的洗脫峰即為融合蛋白。收集的融合蛋白脫鹽后，加入SUMO蛋白酶和終濃度2 mmo l/L的DTT，30 ℃切割1 h，再經Ni-NTA柱親和層析，收集流出液進行SDS-PAGE 電泳檢測。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 CPPs-P53以及 P53蛋白的 Western blotting印跡檢測

取純化的兩個重組蛋白經SDS-PAGE后，將蛋白轉移至NC膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入鼠抗人P53單克隆抗體 (1/50稀釋)，4 ℃孵育過夜。PBST洗膜3次，每次5 min。再加入HRP標記羊抗鼠IgG (1/7 500稀釋)，37 ℃溫育1 h，PBST和PBS各洗膜3次后，ECL化學發(fā)光顯影，同時以BSA作為對照。

1.6 CPPs-P53以及P53對HepG2和U251細胞生長的抑制試驗

取對數生長期人肝癌 HepG2細胞及腦膠質瘤細胞U251，經0.25%胰酶消化后，用含10%小牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液調節(jié)細胞密度為1×105/mL，并接種于 96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔100 μL。置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后吸去上層培養(yǎng)液，將純化后CPPs-P53以及P53蛋白稀釋至1 mg/mL，并以此濃度為起始濃度按1∶2倍比稀釋后加入各孔，每孔 200 μL，每個濃度梯度各設5個復孔，共設置7個稀釋度。設只加入培養(yǎng)液的空白對照及不孵育蛋白的細胞為陰性對照。培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加20 μL MTT (5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，向每孔加入150 μL二甲亞砜溶解甲瓚，振蕩10 min后檢測A570，以空白組平均值調零，按以下公式計算抑制率：

細胞生長抑制率=正常細胞孔平均OD值/對照孔平均OD值?實驗孔平均OD值/對照孔平均OD值

1.7 AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡

將HepG2及U251細胞懸液接種6孔細胞培養(yǎng)板，每孔加2 mL，置37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，根據MTT結果，細胞完全貼壁后換濃度為0.25 mg/mL的CPPs-P53和P53的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)36 h后，用0.25%的胰酶消化細胞 (0.5×106～1×106)，用 PBS 洗 2 次，加入 500 mL結合緩沖液懸浮細胞，加入 FITC標記的 5 μL Annexin-V，混勻避光反應 30 min，再加入 5 μL PI和300 μL結合緩沖液，避光反應5～15 min后，立即用流式細胞術定量檢測 (一般不超過1 h)，同時以不孵育蛋白的細胞一管作為陰性對照。

2 結果

2.1 p53基因的獲得

從人外周血中提取的 RNA樣品通過 1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。從電泳圖中可以清楚地看到28 S，18 S和5 S三條帶，表明總RNA完整性較好，提取的總RNAOD260/OD280分布在1.8～2.0之間，表明質量較好 (圖1)。質粒經PCR后，得到了與預期結果1 182 bp大小相同的條帶(圖2)。測序結果經過NCBI上blast比對，與突變株TP53 (GenBank Accession No. NM_000546)同源性達到100%，證明p53目的基因已經克隆成功。

圖1 人外周血總RNAFig. 1 Total RNA of human peripheral blood. M: DNA marker; 1?3: total RNA.

圖2 目的基因的克隆Fig. 2 Amplification of p53 and CPPs-p53 by PCR. M:DNA marker; 1: p53; 2: CPPs-p53; 3: negative control.

2.2 CPPs-P53重組蛋白的制備及鑒定

將獲得p53基因成功地插入高效原核表達系統pHisSUMO-9R載體以及pHisSUMO載體，并轉化至大腸桿菌中，成功表達 CPPs-P53融合蛋白以及P53蛋白，兩種重組蛋白在37 ℃時，選取0.25 mmol/L IPTG誘導表達，取不同誘導時間的誘導菌進行SDS-PAGE。結果顯示，獲得與預期的蛋白分子量 (約 66 kDa) 大小相一致的CPPs-P53以及P53，但兩種目的蛋白均以包涵體的形式表達。改變誘導溫度為20 ℃，摸索誘導劑IPTG (0.1～1.0 mmol/L) 在不同濃度下的誘導情況。經灰度掃描分析，結果顯示融合蛋白CPPs-P53以包涵體的形式表達 (圖3)，目的蛋白P53 90%以上以可溶形式存在 (圖 4)。利用pHisSUMO載體表達外源蛋白時，融合蛋白N端含有6×His標簽，可以利用Ni-NTA層析柱進行純化。CPPs-P53表達菌破碎后離心的沉淀經包涵體變性復性以及透析等技術得到 SUMOCPPs-P53蛋白；P53表達菌破碎后上清經親和層析得到唯一的洗脫峰即為SUMO-P53融合蛋白。融合蛋白經SUMO ProteaseⅠ酶切并純化后獲得成熟CPPs-P53融合蛋白和P53蛋白 (圖5、6)。經Western blotting印跡分析表明，這兩個成熟蛋白均可與鼠抗人 P53的單克隆抗體發(fā)生特異性反應，而與其他蛋白無反應，證實了所表達的蛋白的特異性(圖7)。

圖3 目的蛋白pSUMO-P53的表達Fig. 3 SDS-PAGE analysis of expression of SUMO-P53. M: marker; 1: negative control; 2?8:soluble after IPTG induct 1 h, 2 h, 3 h, 4 h; 3?9:inclusion after IPTG induct 1 h, 2 h, 3 h, 4 h.

圖4 目的蛋白SUMO-CPPs-P53的表達Fig. 4 SDS-PAGE analysis of expression of SUMO-CPPs-P53. M: marker; 1: negative control; 2?8:soluble after IPTG induct 1 h, 2 h, 3 h, 4 h; 3?9:inclusion after IPTG induct 1 h, 2 h, 3 h, 4 h.

2.3 重組CPPs-P53能更有效抑制腫瘤細胞的生長

將HepG2細胞和U251細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)24 h，吸去上層培養(yǎng)液。將純化后的兩種重組蛋白均稀釋至1 mg/mL，并以此濃度為起始濃度按 1∶2倍比稀釋后加入各孔，每個稀釋度5個復孔，同時設不加任何蛋白孵育的細胞為陰性對照組；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后測定吸光度并計算細胞生長抑制率。以各孔所加蛋白濃度的稀釋度為橫坐標，以細胞生長抑制率為縱坐標作圖 (圖 8、9)，從中可以看出 P53蛋白對 HepG2和U251的細胞生長均有一定的抑制作用，而融合蛋白CPPs-P53對HepG2和U251的細胞生長的抑制作用更加顯著，并呈現劑量依賴性。CPPs-P53處理的HepG2細胞的MTT檢測結果顯示，其細胞生長抑制率比P53高2～8倍。CPPs-P53蛋白對于 U251細胞的 MTT檢測結果顯示，其抑制率比P53高1～2倍。生物統計學分析顯示，CPPs-P53融合蛋白與 P53相比對腫瘤細胞的抑制效果更好，差異極顯著 (*P<0.05；**P<0.01)。由此推斷9個精氨酸的穿膜肽能攜帶P53蛋白進入細胞內并更好地抑制癌細胞的生長。

圖5 成熟CPPs-P53融合蛋白的制備Fig. 5 Mature CPPs-P53 fusion protein. M: marker; 1:mature CPPs-P53 protein; 2: fusion protein after Protease cleavage.

圖6 成熟P53蛋白的制備Fig. 6 Mature P53 protein. M: marker; 1: fusion protein after Protease cleavage; 2, 3: mature P53 protein.

圖7 CPPs-P53及P53的Western blotting分析Fig. 7 Western blotting analysis of the recombinant CPPs-P53 and P53. 1: BSA; 2: P53; 3: CPPs-P53.

圖8 目的蛋白作用于HepG2細胞的MTT檢測結果Fig. 8 MTT assay of HepG2 treated with target protein.

細胞生長抑制率=正常細胞孔平均OD值/對照孔平均OD值?實驗孔平均OD值/對照孔平均OD值

圖9 目的蛋白作用于U251細胞的MTT檢測結果Fig. 9 MTT assay of U251 treated with target protein.

2.4 重組 CPPs-P53更有效地誘導腫瘤細胞凋亡

將HepG2及U251接種于6孔細胞培養(yǎng)板，細胞完全貼壁后更換含P53和CPPs-P53的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)36 h后消化細胞，經FITC標記的Annexin-V和PI處理過的細胞用流式細胞儀檢測細胞的凋亡，結果見圖10。圖中Q1門為壞死的細胞，Q2門為晚期凋亡的細胞，Q3門為正常細胞，Q4門為早期凋亡的細胞。圖10A為HepG2空白對照的檢測結果，晚期凋亡細胞約占3.1%，早期凋亡細胞約為3.2%。圖10B為加入P53蛋白的檢測結果，晚期凋亡細胞約占 8.2%，早期凋亡細胞約為2.3%。圖10C為加入CPPs-P53融合蛋白的檢測結果，晚期凋亡細胞約占21.1%，早期凋亡細胞約為1.7%。如圖10A-C所示，與P53相比，CPPs-P53誘導 HepG2細胞發(fā)生凋亡的效果更為顯著，晚期凋亡效果尤其顯著，凋亡率提高了12.9%。圖10D為U251空白對照的檢測結果，晚期凋亡細胞約占 4.8%，早期凋亡細胞約為0.6%。圖10E為加入P53蛋白的細胞檢測結果，晚期凋亡細胞約占 5.4%，早期凋亡細胞約為1.9%。圖10F為加入CPPs-P53融合蛋白的檢測結果，晚期凋亡細胞約占14.0%，早期凋亡細胞約為3.1%。如圖10D-F所示，與P53相比，CPPs-P53誘導 U251細胞發(fā)生凋亡的效果更為顯著，晚期凋亡的效果顯著，凋亡率提高了8.6%。由此推斷CPPs-P53中的9個精氨酸的穿膜肽能有效攜帶P53蛋白進入細胞內，顯著提高了HepG2和U251細胞的凋亡。

3 討論

目前已經成藥并應用于疾病治療的生物大分子藥物主要有酶、激素、細胞因子以及抗體等，它們或是直接發(fā)揮作用，或是通過細胞膜表面受體發(fā)揮效應。而像P53一類的信號傳導蛋白卻因為細胞膜的天然屏障而久久不能得以應用，此類蛋白若不能進入細胞，就很容易在機體內發(fā)生降解，難以發(fā)揮高效、穩(wěn)定的生物學作用[17]，細胞穿膜肽的出現有望化解這一瓶頸，為多種蛋白分子成藥提供了新的途徑。細胞穿膜肽作為一種具有高效穿膜活性的非病毒載體，不僅轉導效率高，而且可以攜帶各種大分子物質進入細胞內，并保持其生物活性，具有廣闊的應用前景。而9個精氨酸構成的穿膜肽保證了穿膜所需的最大的內在化作用，同時其肽分子較短，更有利于其與攜帶的生物分子融合表達[18]。

圖10 P53以及CPPs-P53作用HepG2、U251細胞Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率Fig. 10 Apoptotic analyses of HepG2 and U251 treated with P53 and CPPs-P53 by Annexin-V-FITC/PI method. (A)HepG2 blank contrast. (B) Apoptosis of HepG2 treated with P53. (C) Apoptosis of HepG2 treated with CPPs-P53. (D)U251 blank contrast. (E) Apoptosis of U251treated with P53. (F) Apoptosis of U251treated with CPPs-P53.

隨著惡性腫瘤的發(fā)生率越來越高，人們一直在尋求一種有效的治療手段。腫瘤的發(fā)生是多種因素綜合作用的結果，其中包括各種基因的調節(jié)作用，原癌基因的激活以及抑癌基因的失活等，而p53基因是目前研究最廣泛而深入的抑癌基因，在細胞受到損害導致 DNA斷裂時，P53蛋白可作用于不同層面引起細胞周期阻滯、凋亡或衰老，保持細胞基因組的完整性并清除損傷細胞，其作用途徑包括誘導多種凋亡相關基因的轉錄或通過非轉錄依賴的機制發(fā)揮作用[19]。一旦p53基因缺失或突變失活，則將導致細胞惡性轉化、無限制增殖從而引發(fā)癌癥，因此如果將P53蛋白導入腫瘤細胞就能發(fā)揮有效的抗腫瘤作用[20]。

P53蛋白本身就是核內磷酸化蛋白，必須進入到核內才能發(fā)揮其功能，因此將P53蛋白帶到細胞內部成為首要解決的問題。本實驗成功構建質粒 pHisSUMO-p53以及 pHisSUMO-9R-p53，并在E. coli表達系統中大量表達，純化獲得了重組的P53及CPPs-P53蛋白。通過Western blotting檢測顯示表達的蛋白分子量正確，經灰度分析表明蛋白純度均高于 90%以上。MTT及 Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡的實驗中，MTT檢測表明重組 P53對腫瘤細胞的生長有一定的抑制作用，CPPs-P53與 P53相比，對腫瘤細胞的生長抑制效果更加顯著，并且細胞生長抑制率呈現劑量依賴性。MTT檢測結果顯示，CPPs-P53對HepG2細胞的生長抑制效果尤為突出，細胞生長的抑制率可高達P53的8倍，對U251的抑制率也達到了P53的2倍。AnnexinV/PI雙染檢測細胞凋亡的結果表明 P53可以在一定程度上誘導細胞的凋亡，CPPs-P53與 P53相比，細胞凋亡率明顯增加，對于HepG2和U251兩種細胞的凋亡率均提高了 2～3倍。總之，9R攜帶的 P53(CPPs-P53) 在抑制腫瘤細胞的生長方面比沒有穿膜肽的P53蛋白效果更顯著，同時也驗證了9個精氨酸確實有攜帶P53進入細胞的作用。

現如今，生物大分子治療疾病的報道如雨后春筍般涌現，各種藥物載體之間的聯合使用、與高分子聚合物的結合，在腫瘤靶向治療[21]、基因治療、增強藥物吸收、建立新型給藥方式及炎癥免疫治療等研究領域均具有良好的應用前景。目前，尚未發(fā)現有9R攜帶P53融合蛋白治療癌癥的報道。雖有表達PTD-P53及11R-P53融合蛋白的研究，但報道的內容均局限于細胞穿膜肽可以將蛋白分子帶入細胞內部的驗證。本實驗報道了9個精氨酸攜帶的P53蛋白對于腫瘤細胞的生長存在抑制作用并能高效誘導細胞凋亡。對于依賴于病毒載體的基因治療，可以將 9R-P53插入病毒表達載體中，以融瘤的方式治療癌癥；對于不依賴于病毒載體的基因治療，可以通過表達能穿透細胞膜的重組的融合蛋白進行基因調控治療癌癥。本實驗驗證了帶有9R穿膜肽的P53的抗腫瘤效果，為進一步研究P53在細胞內的作用機制，應用P53蛋白進行腫瘤的生物治療提供了一種新的思路和策略，為開辟腫瘤治療新途徑奠定了重要基礎。

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