慢病毒載體轉(zhuǎn)錄通讀率檢測方法的建立

何佳平，方彧聃 ，張帆，孫鳳強(qiáng)，王娟,2，張敬之 ,2

1 上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所，上海 200040

2 衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)胚胎分子生物學(xué)重點實驗室暨上海市胚胎與生殖工程重點實驗室，上海 200040

轉(zhuǎn)錄通讀 (Read-through) 是指RNA聚合酶復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄過程中遇到轉(zhuǎn)錄終止信號 (如AAUAAA signal) 時不能被正常終止，而是讀過終止信號繼續(xù)轉(zhuǎn)錄下游DNA序列的現(xiàn)象 (圖1)。它經(jīng)常發(fā)生在病毒或病毒載體基因的轉(zhuǎn)錄過程中。目前廣泛使用的第3代慢病毒載體經(jīng)過了自滅活改造 (刪除U3啟動子)，進(jìn)一步降低其產(chǎn)生重組型活病毒的可能性。然而，自滅活改造同時亦刪除了 3端的轉(zhuǎn)錄終止上游序列 (USE) 從而提高了載體的轉(zhuǎn)錄通讀水平[1]。轉(zhuǎn)錄通讀現(xiàn)象的發(fā)生將有可能激活下游原本沉默的基因，這為慢病毒載體用以基因治療帶來了生物安全性方面的風(fēng)險[2]。為了規(guī)避這種風(fēng)險，研究者嘗試在病毒載體中插入隔離子來降低通讀率[3-7]。而建立一種快速有效的通讀率檢測方法，對于評估以上工作的效果，提高病毒載體的生物安全性具有重要意義。

目前測定轉(zhuǎn)錄通讀水平的方法主要是通過流式細(xì)胞儀等手段，定量轉(zhuǎn)錄通讀 mRNA所表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。為了建立一種檢測轉(zhuǎn)錄通讀實際情況的方法，我們利用整合入染色體上的慢病毒載體原病毒 (Pro-viral vector) 的轉(zhuǎn)錄本中不存在5端U3，而只存在3端U3的原理，首先將總的病毒載體轉(zhuǎn)錄本以及其轉(zhuǎn)錄通讀轉(zhuǎn)錄本用相應(yīng)的不同的下游特異引物進(jìn)行分別反轉(zhuǎn)錄，然后使用特異針對3端的U3定量引物和探針，通過

qRT-PCR來對轉(zhuǎn)錄通讀率進(jìn)行絕對定量。在此，我們的轉(zhuǎn)錄通讀率定義是：通讀mRNA的數(shù)量/(正常mRNA的數(shù)量+通讀mRNA的數(shù)量) ×100%。

本研究以攜帶野生型 LTR (wLTR) 和自滅活LTR (ΔLTR) 的兩種慢病毒載體作為研究對象進(jìn)行通讀率的檢測，同時運用檢測通讀相對量的傳統(tǒng)方法加以驗證，以顯示該方法的有效性和準(zhǔn)確性。

圖1 病毒載體的轉(zhuǎn)錄通讀現(xiàn)象Fig. 1 Phenomenon of transcriptional Read-through in viral vectors.

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌 TPO10宿主菌、pEGFP-N1載體(Invitrogen，美國) FUGW，NL4.3 (Addgene)，PyrobestTaqE，ExTaqE，T4 DNA 連接酶，ApaⅠ，XhoⅠ，MluⅠ，NheⅠ，dNTPs，RTase M-MLV，RNase Inhibitor (TaKaRa，日本)，Pac(New ⅠEngland Biolabs，NEB，美國) lipofectimin2 000，Trizol (Invitrogen公司)，引物合成 (Generay公司，上海)，定量引物及MGB探針合成 (GeneCore公司，上海)。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建

用 PCR方法擴(kuò)出 HIV-1病毒株 NL4.3的3野生型 wLTR，擴(kuò)增引物為 wLTR-XhoⅠ-F和wLTR-ApaⅠ-R。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ和ApaⅠ雙酶切后，接入pEGFP-N1多克隆位點SalⅠ和ApaⅠ之間，構(gòu)建出 pEGFP-N1-wLTR載體 (圖 2A)。用XhoⅠ和ApaⅠ雙酶切下慢病毒載體FUGW上的經(jīng)刪減 U3的 3LTR，接入 pEGFP-N1的SalⅠ和ApaⅠ之間，構(gòu)建出 pEGFP-N1-ΔLTR 載體(圖 2B)。上述兩個載體主要用于檢測3LTR的通讀情況。

用分子克隆手段在FUGW的U5和flap之間插入一個單一的NheⅠ位點，得到FUGW (NheⅠ)載體。隨后在此基礎(chǔ)上，將3LTR接入MluⅠ和NheⅠ之間獲得 proFUGW-ΔLTR 載體 (圖 2D)；將兩個 3wLTR 分別接入MluⅠ、NheⅠ之間和XhoⅠ、ApaⅠ之間獲得 proFUGW-wLTR 載體(圖2C)。上述兩個載體可以用來模擬慢病毒整合入宿主基因組的情況，使檢測更接近于實際的通讀情況。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將 pEGFP-N1、pEGFP-N1-LTR、pEGFP-N1-wLTR、proFUGW-ΔLTR 和 proFUGW-wLTR 5種載體，以等摩爾方式用lipofectimin 2 000轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞后，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)48 h，經(jīng)0.25%胰酶消化細(xì)胞5～10 min后用含血清培養(yǎng)液終止反應(yīng)。將細(xì)胞和培養(yǎng)液收集入1.5 mL的管中，離心棄上清后待用。

圖2 載體構(gòu)建圖Fig. 2 Schematic diagram of the vectors. (A) pEGFP-N1-wLTR. (B) pEGFP-N1-ΔLTR. (C) proFUGW-wLTR.(D) proFUGW-ΔLTR.

1.2.3 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄通讀率

用 Trizol提取 pEGFP-N1-LTR、pEGFP-N1-wLTR、proFUGW-LTR和proFUGW-wLTR，4種載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的總 RNA。待分光光度計測定濃度后，取相同量的 RNA，分別用引物 RP和LTR3進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。這兩條引物分別設(shè)計在3LTR的R區(qū)域中PolyA信號 (AAUAAA) 位點的前后(圖 3)。取 cDNA產(chǎn)物作為模版，以 FP、RP作為引物，以 MGB-Probe作為探針，進(jìn)行定量PCR。反轉(zhuǎn)錄及定量反應(yīng)體系同參考文獻(xiàn)[8]，所用引物探針序列見表1。ABI 7 500實時定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；59 ℃時采集熒光，熒光檢測波長為FAM 510 nm。反應(yīng)結(jié)束后通過定量 PCR儀的分析軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，并計算出通讀率的變化：通讀率=通讀mRNA (以LTR3為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA)/總 mRNA (以 PA-RP為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA)。

1.2.4 熒光顯微鏡檢測

在已離心棄上清的轉(zhuǎn)染細(xì)胞沉淀中加入100 μL PBS，取少量單細(xì)胞懸液置于熒光顯微鏡下鏡檢，并檢測GFP陽性細(xì)胞數(shù)及熒光強(qiáng)度。

1.2.5 FACS檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光強(qiáng)度

取50 μL細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL以PBS為主的鞘液，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，計數(shù)5×104個細(xì)胞，計算GFP平均熒光強(qiáng)度。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel自帶統(tǒng)計軟件包，進(jìn)行實驗組間單因素方差分析。

圖3 基于qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄通讀率的方法Fig. 3 Flowchart of detecting Read-through rate by qRT-PCR.

表1 引物和探針序列Table 1 List of primers and probes

2 結(jié)果與分析

2.1 在 pEGFP-N1報告基因載體系統(tǒng)中檢測病毒元件LTR的轉(zhuǎn)錄通讀率

HIV載體的轉(zhuǎn)錄終止信號位于 3LTR的 R上。為了研究LTR的轉(zhuǎn)錄終止能力，我們把野生型 HIV的 LTR (wLTR) 和自滅活慢病毒載體的LTR (ΔLTR) 分別插入到表達(dá)載體pEGFP-N1中的多克隆位點 (MCS) 上 (圖 2A，B)，即位于CMV啟動子和報告基因EGFP之間。EGFP表達(dá)越強(qiáng)表明LTR的轉(zhuǎn)錄終止能力越弱，而轉(zhuǎn)錄通讀水平越高。

2.1.1 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄通讀率

帶有兩種類型LTR元件的表達(dá)載體pEGFPN1-ΔLTR和 pEGFP-N1-wLTR分別瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后提取細(xì)胞的總RNA，經(jīng)DNaseⅠ(RNase free) 處理去除殘留的質(zhì)粒DNA和基因組DNA。通過qRT-PCR的方法檢測LTR的轉(zhuǎn)錄通讀率。結(jié)果顯示 (圖4)，自滅活慢病毒載體的 ΔLTR轉(zhuǎn)錄通讀率達(dá)到了 64%，而 HIV病毒野生型wLTR的轉(zhuǎn)錄通讀率較低，約為36%(n≥5，P＜0.01)。

圖4 qRT-PCR檢測pEGFP-N1-wLTR和pEGFPN1-ΔLTR的轉(zhuǎn)錄通讀率Fig. 4 Read-through rate of pEGFP-N1-wLTR and pEGFP-N1-ΔLTR detected by qRT-PCR.

2.1.2 通過檢測 EGFP的蛋白表達(dá)來驗證轉(zhuǎn)錄通讀的效率。

基于 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄通讀的方法檢測到的是通讀率的絕對數(shù)值。為了驗證該方法的準(zhǔn)確性，我們在蛋白水平檢測了轉(zhuǎn)錄通讀的相對水平。表達(dá)載體 pEGFP-N1-ΔLTR 和 pEGFP-N1-wLTR分別瞬時轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞 (以轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的293T作為陰性對照)。轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)水平。熒光圖片顯示 (圖 5) 插入 ΔLTR和 wLTR以后 EGFP陽性細(xì)胞數(shù)與陰性對照組相比均有顯著的減少。這說明這兩種LTR均有轉(zhuǎn)錄終止能力。但是，插入wLTR組比插入ΔLTR組的陽性細(xì)胞數(shù)要少的多，這說明ΔLTR比wLTR的轉(zhuǎn)錄通讀率要高。上述細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，進(jìn)行 FACS檢測。FACS結(jié)果 (圖 6) 與熒光鏡檢的結(jié)果相一致，插入wLTR組的平均熒光強(qiáng)度比插入ΔLTR組弱55%左右 (n≥5，P＜0.01)。也就是說 ΔLTR的轉(zhuǎn)錄通讀率高于wLTR，這一結(jié)果與qRT-PCR的結(jié)果相一致。因此，熒光顯微鏡鏡檢結(jié)果和FACS結(jié)果均驗證了我們建立的基于 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄通讀率方法的準(zhǔn)確性。

2.2 模擬病毒載體整合入染色質(zhì)后的轉(zhuǎn)錄通讀率檢測

病毒載體顆粒感染細(xì)胞后，釋放出mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成兩端帶有兩個相同 LTR的雙鏈DNA，并且整合入染色體中。整合入染色體中的病毒DNA被稱為原病毒。檢測病毒載體整合入細(xì)胞基因組中的轉(zhuǎn)錄通讀率比檢測單個 LTR的通讀率更能反映其在染色體上的實際情況。由于慢病毒載體的隨機(jī)整合特性，載體整合位點附近的染色體環(huán)境將極大地影響轉(zhuǎn)錄通讀率。為了規(guī)避染色體環(huán)境因素的影響，我們用質(zhì)粒來模擬病毒載體整合入基因組的序列，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄通讀率的檢測。

圖5 pEGFP-N1、pEGFP-N1-wLTR和pEGFP-N1-ΔLTR轉(zhuǎn)染293T的熒光顯微鏡鏡檢圖 (400×)Fig. 5 Microscopic observation of 293T cells transfected with pEGFP-N1, pEGFP-N1-wLTR and pEGFP-N1-ΔLTR(400×). (A) 293T cells transfected with pEGFP-N1. (B) 293T cells transfected with pEGFP-N1-ΔLTR. (C) 293T cells transfected with pEGFP-N1-wLTR. A1, B1, C1: microscopic photos under the natural light; A2, B2, C2: microscopic photos under the natural light plus fluorescence; A3, B3, C3: microscopic photos under the fluorescence.

圖6 pEGFP-N1、pEGFP-N1-wLTR和pEGFP-N1-ΔLTR的平均熒光強(qiáng)度Fig. 6 Mean fluorescent intensity of pEGFP-N1,pEGFP-N1-wLTR and pEGFP-N1-ΔLTR by FACS.

原病毒模擬載體 proFUGW-ΔLTR 和proFUGW-wLTR (圖 2C，D) 分別轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，通過基于qRT-PCR的方法檢測轉(zhuǎn)錄通讀率。檢測結(jié)果顯示 (圖7)，自滅活慢病毒載體的轉(zhuǎn)錄通讀率為 59%左右，而攜帶wLTR的慢病毒載體轉(zhuǎn)錄通讀率約為22% (n≥9，P＜0.01)。

3 討論

慢病毒載體是研究者們對人類 1型艾滋病毒 (Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1) 進(jìn)行拆分，改造而形成的一種高效基因介導(dǎo)載體[9-11]。

圖7 qRT-PCR檢測proFUGW-wLTR和proEGFPN1-ΔLTR的轉(zhuǎn)錄通讀率Fig. 7 Read-through rate of proFUGW-wLTR and proEGFP-N1-ΔLTR detected by qRT-PCR.

在HIV-1的LTR (即wLTR) 中已知的轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控序列包括：位于R區(qū)的多聚腺苷酸化信號AAUAAA元件，AAUAAA上游 59～76 nt、77～94 nt、141～176 nt間的 3個 USEs[12-14]，位于U5富含 GC的 DSE[15-16]和位于 R和 U5接界的Poly (A) 位點[17]。慢病毒載體自滅活改造時，在刪除U3啟動子的同時刪除了3'端的轉(zhuǎn)錄終止的一系列上游序列[18]。經(jīng)刪減后的LTR (即ΔLTR)與wLTR相比其通讀率有顯著的提高[1]。

而轉(zhuǎn)錄通讀的危害在臨床基因治療中已有體現(xiàn)。在運用 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行臨床基因治療的過程中，一些接受治療的病人卻相繼得了白血病[19-21]。

與γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體類似，在使用自滅活慢病毒載體進(jìn)行基因治療的過程中，同樣存在著因轉(zhuǎn)錄通讀而造成激活下游基因的風(fēng)險。正因如此，在用慢病毒載體治療-地中海貧血的過程中，科學(xué)家們在△U3中插入了兩個拷貝的雞隔離 子 (The chicken β-globin 5′ DNaseⅠhypersensitive site 4 insulator，CHS4) 以減少轉(zhuǎn)錄通讀率[22]。所以，在改造載體前后，需要有一種能夠準(zhǔn)確檢測及評估通讀率的方法。文中我們描述了用 qRT-PCR確定其轉(zhuǎn)錄通讀的實際值的方法。在此過程中，我們使用了兩套不同的特異性引物對慢病毒載體總轉(zhuǎn)錄本和通讀轉(zhuǎn)錄本分別進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄; 在此基礎(chǔ)上，采用了同一套定量引物和探針分別對它們進(jìn)行定量，從而避免了在擴(kuò)增過程中兩組cDNA的擴(kuò)增效率的差異，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

Yang等2007年報道了一種檢測單一LTR轉(zhuǎn)錄通讀率的較為復(fù)雜的方法，他們使用了 LacZ報告基因表達(dá)后染色來直觀地顯示通讀率[1]。他們在蛋白活性上的檢測數(shù)據(jù)與我們在 mRNA水平上模擬慢病毒載體在染色體上的情況相比盡管趨勢相同，但數(shù)值小了很多，有可能是由于額外的翻譯因素所造成的，因此，與他們的方法相比，我們的方法有可能更加準(zhǔn)確地體現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄通讀的實際情況。通過對3'LTR和3'wLTR分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的分析，我們認(rèn)為，我們所建立的方法能夠有效和真實地體現(xiàn)慢病毒載體的轉(zhuǎn)錄通讀率，為慢病毒載體改進(jìn)工作提供了技術(shù)支持。

致謝：衷心感謝曾溢滔院士和任兆瑞教授對本文的悉心指導(dǎo)。

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