高通量miRNA活性譜檢測發(fā)現(xiàn)BHK21細(xì)胞中miR-206高活性

田文洪，董小巖，王剛，鄭剛，周慶璋，董哲岳，吳小兵

1 吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012

2 北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司，北京 101111

3 中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

microRNAs (miRNAs) 作為動(dòng)物體中內(nèi)源性的非編碼小 RNA，通過抑制基因表達(dá)，調(diào)節(jié)多種生理過程，是動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子[1-3]。miRNA的表達(dá)和活性具有明顯的組織特異性[4-6]，與多種生理病理過程密切相關(guān)[7-9]。不同細(xì)胞系因其來源和建立過程的差異呈現(xiàn)出不同的 miRNA表達(dá)和活性譜。因此 miRNA表達(dá)和活性譜有可能成為一種生物標(biāo)記用于細(xì)胞系的區(qū)分和鑒定。BHK21細(xì)胞來源于金黃地鼠腎臟組織，是一種廣泛應(yīng)用的細(xì)胞系[10]。BHK21細(xì)胞與其他腎臟組織來源細(xì)胞 (如 Vero、HEK293和MDCK) 明顯不同，被鑒定為成纖維細(xì)胞[11]。該差異是否也體現(xiàn)在miRNA水平上，值得進(jìn)一步研究。

本課題組最近建立了一種活細(xì)胞中 miRNA活性譜檢測技術(shù)[12]。本研究擬將該技術(shù)應(yīng)用于BHK21、HEK293和 Vero三種腎臟來源細(xì)胞的miRNA活性譜檢測，比較分析找出BHK21細(xì)胞中特異性高活性miRNA，并用QRT-PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證，為從miRNA水平揭示BHK21細(xì)胞的特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

miRNA Asensor和 Control Asensor分別為miRNA活性檢測和對(duì)照傳感器。傳感器為攜帶螢火蟲熒光素酶 (Firefly luciferase，F(xiàn)luc) 表達(dá)框和分泌型熒光素酶 (Gaussialuciferase，Gluc)表達(dá)框的腺相關(guān)病毒 (Adeno-associated virus，AAV) 載體，其中Fluc表達(dá)框用于校正不同傳感器之間轉(zhuǎn)導(dǎo)效率差異，Gluc表達(dá)框中含有miRNA靶序列，用于檢測 miRNA活性[12]。Control Asensor的 Gluc表達(dá)框不攜帶任何miNRA靶序列，miRNA Asensor的Gluc表達(dá)框攜帶單個(gè)的完全互補(bǔ)的miRNA靶序列。Control Asensor和miRNA Asensor均由北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所制備和保存。BHK-21 [C-13](ATCC No. CCL-10)、HEK293 (ATCC No. CRL-1573)、Vero (ATCC No. CCL-81) 和C2C12細(xì)胞 (ATCC No. CRL-1772) 購自ATCC。DMEM培養(yǎng)基購自北京清大天一生物技術(shù)有限公司。胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、馬血清 (Horse serum，HS) 和Trizol試劑購自Invitrogen公司。細(xì)胞總蛋白提取試劑盒-I購自北京普利萊生物技術(shù)有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒為 Pierce產(chǎn)品。鼠抗MHC一抗和鼠抗β-actin一抗為Abcam公司產(chǎn)品。鼠抗 Cx43一抗為 Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。堿磷酶標(biāo)記馬抗鼠二抗為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。BCIP/NBT為德國Calbiochem公司產(chǎn)品。Fluc和Gluc活性檢測試劑盒分別為Promega和NEB公司產(chǎn)品。TaqMan MicroRNAs Assay試劑盒為ABI公司產(chǎn)品。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用 microRNAviewer (http://people.csail.mit.edu/akiezun/microRNAviewer) 在線工具分析miRNA序列同源性[13]，找出人、小鼠、大鼠和斑馬魚中成熟序列完全相同的miRNA種類，從本課題組已經(jīng)制備好的 260種 miRNA Asensors中，找出相應(yīng)的miRNA Asensor。從NCBI的蛋白數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)中搜索獲得人、小鼠、大鼠和斑馬魚Cx43蛋白序列，應(yīng)用Vector NTI11.5軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析；從NCBI的GenBank中搜索獲得人、小鼠、大鼠和斑馬魚 Cx43蛋白相應(yīng) mRNA的 3′UTR序列，根據(jù)種子序列 (Seed sequence) 原則[14-15]預(yù)測miRNA靶序列。

1.3 miRNA活性檢測陣列制備

根據(jù)1.2所敘述方法，選擇獲得58種miRNA Asensor。按照一定的順序用Liquidator 96手動(dòng)移液工作站將 Control Asensor和 miRNA Asensor加入 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔所加 miRNA Asensor量為 2.5×108vg (viral genome)/20 μL，每種miRNA Asensor三個(gè)復(fù)孔。然后，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)放入超凈工作臺(tái)中自然干燥完全，獲得miRNA活性檢測陣列miRNA Asensor array，放于 2～8 ℃保存。每次制備多套 miRNA Asensor array。取出一套 miRNA Asensor array，加入BHK21細(xì)胞，48 h后按照說明書用Fluc活性檢測試劑盒測定Fluc表達(dá)活性，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的公式計(jì)算出本套miRNA Asensor array的轉(zhuǎn)導(dǎo)系數(shù)(Transduction coefficient，TC)[12]，用于校正不同Asensor之間的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率差異。

1.4 BHK21、HEK293和 Vero細(xì)胞 miRNA活性譜檢測

用 10% FBS DMEM 培養(yǎng)基將 BHK21、HEK293和Vero細(xì)胞分別以1×104/孔的密度接種miRNA Asensor array，放置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。48 h后，每孔吸取20 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清，用 Gluc活性檢測試劑盒參照說明書檢測Gluc活性。計(jì)算Control Asensor的Gluc活性與miRNA Asensor的Gluc活性的比值，即抑制倍數(shù)(Inhibiting fold，IF)。用 miRNA Asensor的 IF值與 TC值的乘積，即相對(duì)抑制倍數(shù) (Relative inhibiting fold，RIF) 表示miRNA活性。

1.5 倒置顯微鏡觀察 BHK21形態(tài)變化和Western blotting檢測MHC和Cx43蛋白表達(dá)

BHK21細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿 (10%FBS，DMEM)，待細(xì)胞 90%融合度時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用 PBS清洗細(xì)胞 2次，棄去 PBS，更換為 2% HS DMEM 培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)置 10% FBS DMEM培養(yǎng)條件為對(duì)照。48 h后，倒置顯微鏡觀察BHK21細(xì)胞并拍照。然后，消化收集細(xì)胞，用PBS清洗2次，蛋白抽提試劑盒-I提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量試劑盒測定細(xì)胞總蛋白濃度。取20 μg細(xì)胞總蛋白上樣，10% SDS-PAGE變性電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。膜用含5%(W/V) 脫脂奶的 TBST (含 0.1% Tween 20的TBS) 封閉后，分別與鼠抗MHC一抗 (1∶100)、鼠抗Cx43一抗 (1∶1 000) 和鼠抗 β-actin一抗(1∶5 000) 孵育，接著再分別與堿磷酶標(biāo)記馬抗鼠二抗 (1∶1 000) 孵育。最后，BCIP/NBT試劑盒顯色并拍照。

1.6 miR-206活性檢測

細(xì)胞接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (1×104個(gè)細(xì)胞/孔)，Control Asensor和 miR-206 Asensor分別以2.5×108vg感染接種細(xì)胞，每種Asensor三個(gè)復(fù)孔，放置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。48 h后，用 Gluc活性檢測試劑盒測定細(xì)胞培養(yǎng)上清Gluc活性，F(xiàn)luc活性檢測試劑盒測定細(xì)胞裂解Fluc活性。利用Fluc活性值計(jì)算miR-206 Asensor的TC值，Gluc活性值計(jì)算IF值，計(jì)算TC值與IF值的乘積，獲得 RIF值，用于表示 miR-206活性。

1.7 QRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-206表達(dá)

Trizol試劑提取細(xì)胞內(nèi)總 RNA，BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀測定提取RNA濃度。TaqMan MicroRNAs Assay試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)miR-206表達(dá)水平，測定過程參照試劑盒說明書。選擇細(xì)胞內(nèi)小RNA U6作為內(nèi)參，細(xì)胞內(nèi)miR-206的相對(duì)表達(dá)水平用2的ΔCt值的次方表示，其中ΔCt值為U6的Ct值和 miR-206的Ct值的差值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS16.0軟件，應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析處理數(shù)據(jù)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 BHK21、HEK293和 Vero三種細(xì)胞 58種miRNA活性譜的獲得

首先，在本課題組已有的260種miRNA活性檢測傳感器miRNA Asensor中，以miRbase數(shù)據(jù)庫中miRNA序列為依據(jù)，通過序列同源性分析，找出了 58種在人、小鼠、大鼠和斑馬魚中成熟序列完全相同的miRNA (表1)，選擇其相應(yīng)的miRNA Asensor，參考以前報(bào)道的方法[12]，制備獲得 58種 miRNA的活性檢測陣列 miRNA Asensor array。然后，利用該陣列檢測獲得了BHK21、HEK293和 Vero三種細(xì)胞中 58種miRNA活性。

在3種細(xì)胞中，58種miRNA總活性明顯不同，其中BHK21細(xì)胞最高，HEK293細(xì)胞次之，Vero細(xì)胞最低；相同的miRNA在 3種細(xì)胞中的活性不盡相同，呈現(xiàn)出不同的活性譜特征 (圖1)。其中肌肉特異性表達(dá)的miR-206在BHK21細(xì)胞中的 RIF值為 34.30±4.31，而在 HEK293和 Vero細(xì)胞的 RIF值分別為：1.85±0.15和 1.43±0.13，表明 BHK21細(xì)胞中 miR-206的活性明顯高于HEK293和Vero細(xì)胞。隨后我們對(duì)該現(xiàn)象進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

表1 miRNA成熟序列表Table 1 Mature sequences for miRNAs

2.2 miR-206在BHK21細(xì)胞中高活性及高表達(dá)

為了驗(yàn)證miR-206在BHK21細(xì)胞中的高活性，以miR-206高表達(dá)細(xì)胞株C2C12為陽性對(duì)照，miR-206不表達(dá)細(xì)胞株HEK293為陰性對(duì)照[16]，利用 miR-206 Asensor分別檢測了 BHK21、HEK293和C2C12三種細(xì)胞中的miR-206活性，QRT-PCR法檢測了 3種細(xì)胞的 miR-206表達(dá)水平。結(jié)果顯示，BHK21和C2C12細(xì)胞中miR-206活性都較高，且BHK21細(xì)胞明顯高于C2C12細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HEK293細(xì)胞中則未檢測到miR-206活性 (圖2A)；與活性水平類似，BHK21和C2C12細(xì)胞中miR-206的表達(dá)水平都較高，且BHK21細(xì)胞明顯高于C2C12細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HEK293細(xì)胞中仍未檢測到miR-206的表達(dá) (圖2B)。結(jié)果證實(shí)了BHK21細(xì)胞中miR-206的高活性及高表達(dá)。

圖1 BHK21、HEK293和Vero細(xì)胞中58種miRNA活性譜Fig. 1 miRNA activity profile for BHK21, HEK293, and Vero cells. 58 miRNA activities were detected using miRNA Asensor array. Each miRNA activity was shown. And miR-206 activity was presented as dark black.

圖2 HEK293、BHK21和C2C12細(xì)胞中miR-206活性及表達(dá)水平Fig. 2 miR-206 activity and expression levels in HEK293, BHK21, and C2C12 cells. (A) miR-206 activity level in the three cell lines. miR-206 activity was assayed in the three cell lines using miR-206 Asensor. And miRNA activity was represented by relative inhibiting fold (RIF). (B) miR-206 expression level in the three cell lines. miR-206 expression level was detected by QRT-PCR. 2ΔCt was used to indicate miR-206 expression level. ΔCt=CtU6?CtmiRNA. RIF, relative inhibiting fold. Error bars correspond to x ±s (n=3). Student’s t-test was used to examine statistical significance of differences. **P<0.01.

2.3 馬血清誘導(dǎo)后BHK21細(xì)胞變化

以前的研究表明 BHK21細(xì)胞培養(yǎng)中撤除牛血清、換成馬血清培養(yǎng)，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞分化并表達(dá)產(chǎn)生肌肉特異性蛋白，呈現(xiàn)出橫紋肌細(xì)胞特點(diǎn)[17]。考慮到miR-206在肌肉細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[18-19]，我們比較分析了換成馬血清誘導(dǎo)培養(yǎng)前后 BHK21細(xì)胞中形態(tài)特征和肌肉特異性蛋白表達(dá)情況以及miR-206活性和表達(dá)水平。結(jié)果顯示馬血清培養(yǎng)BHK21細(xì)胞48 h后，細(xì)胞變長，部分細(xì)胞發(fā)生融合出現(xiàn)多核細(xì)胞 (圖3A)，而且細(xì)胞骨骼肌肌球蛋白重鏈 (Slow skeletal myosin heavy chain，MHC) 表達(dá)升高 (圖 3B)，表明 BHK21細(xì)胞向橫紋肌細(xì)胞分化。馬血清誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后，miR-206活性和表達(dá)水平都明顯上升，且差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖 3C和圖 3D)。

為了進(jìn)一步揭示馬血清誘導(dǎo)培養(yǎng) BHK21細(xì)胞后 miR-206的升高是否引起了相應(yīng)的基因負(fù)調(diào)控作用，用Western blotting檢測了誘導(dǎo)培養(yǎng)前后 BHK21細(xì)胞中連接蛋白 Connexin43 (Cx43)的表達(dá)情況。之所以選擇Cx43蛋白，是因?yàn)樵谌?、小鼠、大鼠和斑馬魚細(xì)胞中Cx43基因mRNA的3′UTR區(qū)都能發(fā)現(xiàn)miR-206的種子序列 (表2)。Cx43基因在人、小鼠、大鼠和斑馬魚之間具有較高的保守性，人和小鼠以及人和大鼠之間的氨基酸序列同源性達(dá)99.7%，大鼠和小鼠之間的氨基酸同源性為100%，人和斑馬魚之間的同源性也高達(dá)60.3% (表2)。檢測結(jié)果顯示，誘導(dǎo)48 h后BHK21細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)下降 (圖3E)，與以前報(bào)道的 miR-206抑制 C2C12細(xì)胞表達(dá)Cx43蛋白，從而調(diào)節(jié) C2C12細(xì)胞發(fā)育成肌細(xì)胞的研究結(jié)果相一致[20]。

圖3 馬血清誘導(dǎo)培養(yǎng)后BHK21細(xì)胞的變化Fig. 3 Changes after differentiation of BHK21 induced by 2% HS. (A) Morphological changes in BHK21 cells induced by 2% HS. Cells were examined by Leica DMI3000 M Simply Microscopy (200×). (B) BHK21 expressed skeletal muscle protein when induced by 2% HS. Slow skeletal myosin heavy chain(MHC) was assayed by Western blotting in BHK21induced with or without 2% HS. (C) miR-206 activity increased in BHK21 induced by 2% HS.miR-206 activity was assayed in BHK21 when it was cultured in the medium with 10% FBS or 2% HS using miR-206 Asensor, respectively. miRNA activity was presented as relative inhibiting fold (RIF). (D) miR-206 expression level increased in BHK21 induced by 2% HS. In the two different culture conditions, miR-206 expression level was tested by QRT-PCR in BHK21. 2ΔCt was used to indicate miR-206 expression level. (E) Cx43 expression decreased in BHK21 induced by 2% HS. Expression of Cx43 was assayed by Western blotting in BHK21 induced with or without 2% HS.ΔCt=CtU6?CtmiRNA. RIF: relative inhibiting fold. Error bars correspond to x ±s (n=3). Student’s t-test was used to examine statistical significance of differences. **P<0.01.

表2 Connexin 43基因生物信息學(xué)分析Table 2 Bioinformatics analysis of Connexin 43 gene

3 討論

BHK21、HEK293和 Vero細(xì)胞是3種常見的腎組織來源細(xì)胞株。不同于 HEK293和 Vero細(xì)胞，BHK21細(xì)胞來源于 1日齡的金黃地鼠腎組織，并鑒定為成纖維細(xì)胞[11]。已有的研究還表明BHK21細(xì)胞具有某些橫紋肌細(xì)胞的特性[16]，提示BHK21的獨(dú)特性。miRNA作為一種廣泛存在于后口動(dòng)物中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)和活性呈現(xiàn)出明顯的時(shí)空特異性，與多種生理病理過程密切相關(guān)，具有成為生物標(biāo)記的潛力[21-24]。本研究試圖用我們建立的活細(xì)胞miRNA活性譜檢測技術(shù)比較 BHK21、HEK293和 Vero三種常見的腎細(xì)胞的 miRNA活性譜，從 miRNA水平上揭示BHK21細(xì)胞的特性。

我們首先掃描獲得了 BHK21、HEK293和Vero三種細(xì)胞中 58種 miRNA活性譜，比較發(fā)現(xiàn)miR-206在BHK21細(xì)胞中特征性高活性。隨后，以成肌細(xì)胞 C2C12為陽性對(duì)照，人胚腎細(xì)胞 HEK293為陰性對(duì)照，進(jìn)一步證明了 BHK21細(xì)胞中miR-206的高活性及高表達(dá)。最后，采用馬血清誘導(dǎo)培養(yǎng)BHK21細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-206活性和表達(dá)水平都升高，并且miR-206的靶基因之一Cx43蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)。

miR-206作為一種肌肉特異性miRNA，主要在肌肉組織及其來源細(xì)胞系中表達(dá)[25]。BHK21細(xì)胞在馬血清誘導(dǎo)培養(yǎng)下部分細(xì)胞發(fā)生融合出現(xiàn)多核細(xì)胞，能夠表達(dá)橫紋肌特征性蛋白，表明BHK21細(xì)胞具有成肌細(xì)胞特性。本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-206在BHK21細(xì)胞中的高活性和高表達(dá)，從miRNA水平上揭示了BHK21細(xì)胞的成肌細(xì)胞特征。而且 BHK21細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，區(qū)別于同為腎臟來源的上皮細(xì)胞樣的 HEK293和 Vero細(xì)胞，說明 BHK21細(xì)胞可能來源于腎臟的間質(zhì)細(xì)胞。

BHK21細(xì)胞經(jīng)馬血清誘導(dǎo)后，miR-206的活性和表達(dá)水平明顯升高，且細(xì)胞間連接蛋白Cx43的表達(dá)水平下降。保守性序列分析發(fā)現(xiàn) BHK21細(xì)胞的Cx43基因的3′UTR區(qū)存在miR-206的靶序列，說明miR-206可能通過抑制Cx43蛋白的表達(dá)參與馬血清誘導(dǎo)的 BHK21發(fā)育分化過程。提示 BHK21細(xì)胞可以作為一種有效的細(xì)胞模型，用于 miR-206的功能和表達(dá)活性調(diào)節(jié)機(jī)制研究。

miR-206在 BHK21細(xì)胞中特征性高活性和高表達(dá)，提示miR-206可以作為一種生物標(biāo)記分子，用于BHK21細(xì)胞的鑒定。BHK21細(xì)胞在誘導(dǎo)分化后miR-206活性和表達(dá)水平明顯升高，提示 miR-206可能作為一種向肌細(xì)胞分化的分子標(biāo)志物。

BHK21細(xì)胞表達(dá)miRNA種類和成熟序列信息的缺乏限制了BHK21細(xì)胞中miRNA表達(dá)和功能性研究。本研究通過miRNA成熟序列同源性分析確定了 58種 BHK21細(xì)胞中可能表達(dá)的miRNA及序列信息，利用活細(xì)胞miRNA活性譜檢測技術(shù)初步了解了58種miRNA在BHK21細(xì)胞中的活性水平，為這些 miRNA的功能研究提供了基礎(chǔ)。

總之，利用活細(xì)胞miRNA活性譜檢測技術(shù)，首次在BHK21細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了miR-206特征性高活性，并驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)，初步探索了miR-206在 BHK21細(xì)胞經(jīng)馬血清誘導(dǎo)分化過程中可能的作用機(jī)制，表明 miR-206可以作為一種 BHK21細(xì)胞特征性的生物標(biāo)記。本研究還提示 BHK21可以用作miR-206功能研究的細(xì)胞模型，BHK21細(xì)胞來源于金黃地鼠腎臟，探索非肌肉來源細(xì)胞中 miR-206的表達(dá)機(jī)制，可能有助于揭示miR-206肌肉特異性表達(dá)的原因。這是我們下一步擬開展的工作。

[1]Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis,mechanism, and function. Cell, 2004, 116(2):281?297.

[2]Ambros V. The functions of animal microRNAs.Nature, 2004, 431(7006): 350?355.

[3]Filipowicz W, Bhattacharyya SN, Sonenberg N.Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nat Rev Genet, 2008, 9(2): 102?104.

[4]Lagos-Quintans M, Rauhut R, Yalcin A, et al.Identification of tissue-specific microRNAs from mouse. Curr Biol, 2002, 12(9): 735?739.

[5]Wienholds E, Kloosterman WP, Miska E, et al.MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science, 2005, 309(5732): 310?311.

[6]Landgraf P, Rusu M, Sheridan R, et al. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell, 2007, 129(7):1401?1414.

[7]Carrington JC, Ambros V. Role of microRNAs in plant and animal development. Science, 2003,301(5631): 336?368.

[8]Schichel R, Boyerrinas B, Park SM, et al.MicroRNAs: key players in the immune system differentiation, tumorigenesis and cell death.Oncogene, 2008, 27(45): 5959?5974.

[9]Sun W, Julie Li YS, Huang HD, et al. microRNA: a master regulator of cellular processes for bioengineering systems. Annu Rev Biomed Eng,2010, 12: 1?27.

[10]Pay TW, Boge A, Menard FJ, et al. Production of rabies vaccine by an industrial scale BHK 21 suspension cell culture process. Dev Biol Stand,1985, 60:171?174.

[11]Stoker M and Macpherson I. Syrian hamster fibroblast cell line BHK21 and its derivatives.Nature, 1964, 203: 1355?1357.

[12]Tian W, Dong X, Liu X, et al. High-throughput functional microRNAs profiling by recombinant AAV-based microRNA sensor arrays. PLoS ONE,2012, 7(1): e29551.

[13]Kiezun A, Artzi S, Modai S, et al. miRviewer: a multispecies microRNA homologous viewer. BMC Res Notes, 2012, 5: 92.

[14]Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets.Cell, 2005, 120(1): 15?20.

[15]Brennecke J, Stark A, Russell RB, et al. Principles of microRNA-target recognition. PLoS Biol, 2005,3(3): e85.

[16]McCarthy JJ. MicroRNA-206: The skeletal muscle-specific myomiR. Biochim Biophys Acta,2008, 1779(11): 682?691.

[17]Schaart G, Pieper FR, Kuijpers HJH, et al. Baby hamster kidney (BHK-21/C13) cells can express striated muscle type proteins. Differentiation, 1999,46(2): 105?115.

[18]Taulli R, Bersani F, Foglizzo V, et al. The muscle-specific microRNA miR-206 blocks human rhabdomyosarcoma growth in xenotransplanted mice by promoting myogenic differentiation. J Clin Invest, 2009, 119(8): 2366?2378.

[19]Chen JF, Tao Y, Li J, et al. microRNA-1 and microRNA-206 regulate skeletal muscle satellite cell proliferation and differentiation by repressing Pax7. J Cell Biol, 2010, 190(5): 867?879.

[20]Anderson C, Catoe H, Werner R. miR-206 regualtes connexin43 expression during skeletal muscle development. Nucleic Acids Res, 2006,34(20): 5863?5871.

[21]Mitchell PS, Parkin RK, Kroth EM, et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(30): 10513?10518.

[22]Cho WC. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.Int J Biochem Cell Biol, 2010, 42(8): 1273?1281.

[23]Mattie MD, Benz CC, Bowers J, et al. Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies. Mol Cancer,2006, 5:24.

[24]Corsini LR, Bronte G, Terrasi M, et al. The role of microRNAs in cancer: diagnostic and prognostic biomarkers and targets of therapies. Expert Opin Ther Targets, 2012, 16(Suppl 2): S103?109.

[25]Politz JC, Zhang F, Pederson T. MicroRNA-206 colocalizes with ribsome-rich regions in both the nucleolus and cytoplasm of rat myogenic cells.Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103: 18957?18962.