hPARP1酶在桿狀病毒/昆蟲細胞中的高表達及快速純化

周海燕，馬軍，楊雪麗，龔笑海，李秋萍，金堅

江南大學醫(yī)藥學院，江蘇 無錫 214122

聚 ADP核糖聚合酶 (Poly ADP-ribose polymerase，PARP)[1]是一種參與DNA修復的核酶，能夠以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 為底物，將聚腺苷二磷酸核糖基轉移到受體蛋白的谷氨酸殘基上，催化合成 PAR聚合物。但在該反應過程中會消耗大量ATP和NAD+，導致細胞死亡。由于PARP的激活在缺血再灌注、糖尿病、炎癥和腫瘤[2]的病理過程中起著重要作用，這預示PARP抑制劑在治療這些疾病中方面有著良好的前景。特別是在腫瘤治療中，PARP已成為一個重要的新的治療靶點[3]。

PARP是一個蛋白超家族，包括 PARP1、PARP2、PARP3、Vault-PARP、TANK1、TANK2和TANK3等亞型[4]，其中對PARP1的研究最為深入和廣泛。PARP1分子量為116 kDa，含有3個主要區(qū)域：N端為46 kDa的DNA結合區(qū)域，中間是一個22 kDa的自我修飾區(qū)域和C端是一個54 kDa的催化區(qū)域。當PARP1的鋅指結構檢測到DNA單鏈或雙鏈斷裂時，PARP1形成二聚體并催化NAD+合成煙酰胺和聚ADP核糖[5]。

聚ADP核糖聚合酶廣泛應用于PARP1抑制劑的篩選、PARP1與其他DNA修復蛋白關系研究等。1986年，Burtscher等[6]首次在大腸桿菌中表達出有活性的PARP1，此后，一些研究學者紛紛發(fā)現(xiàn)酵母細胞[7]、CHO細胞[8]及其昆蟲細胞[9]都可以作為 PARP1的表達宿主，其中昆蟲細胞表達量較高[6-9]，1 L大腸桿菌僅純化出 0.3 mg hPARP1[6]，而僅僅100 mL的昆蟲細胞便可純化出其 10倍以上 hPARP[9]。目前，國內(nèi)尚未見成功表達純化hPARP1研究的報道。

本實驗室從分子構建開始，利用 Bac-to-bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)成功地表達出高活性的hPARP1，并利用 hPARP1酶可以被 3-氨基苯甲酰胺特異性親和的特點純化出了高活性的hPARP1，為PARP1抑制劑的篩選奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、細胞和試劑

hPARP1基因購自 OriGene科技有限公司。質(zhì)粒 pFastBacTM1、大腸桿菌Escherichia coliDH10Bac、Escherichia coliDH5α和草地貪夜蛾卵巢細胞系 (Spodoptera frugiperda9，Sf9) 均由本實驗室保存。脂質(zhì)體轉染試劑 (Lipofection 2000 Reagent) 和 SF900ⅡSFM 昆蟲細胞培養(yǎng)基購自 GIBCO公司；瓊脂糖回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶SgfⅠ和MiuⅠ購自寶生物工程 (大連)有限公司；質(zhì)粒純化試劑盒和T4 DNA連接酶購自生物工程 (上海) 股份有限公司；ECH Sepharose 6B和 EDC購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司；3-氨基苯甲酰胺 (3AB) 購自阿拉丁公司；Anti-PARP1 (sc-74470) 多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology，Anti-mouse IgG-HRP二抗購自 Vector公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 重組桿狀病毒表達質(zhì)粒 Bacmid-hPARP1的構建和鑒定

用SgfⅠ/MiuⅠ雙酶切PCMVhPARP1，回收hPARP1片段，并克隆至 pFastBacTM1的相應位點中，然后轉化大腸桿菌E. coliDH5α感受態(tài)細胞中。鑒定為陽性的重組子點接在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，采用質(zhì)粒純化試劑盒提取重組質(zhì)粒pFast-hPARP1，用SgfⅠ/MiuⅠ雙酶切鑒定，并送上海生工生物技術服務有限公司進行測序。取E. coliDH10Bac感受態(tài)細胞，加入1 ng的重組質(zhì)粒 pFast-hPARP1，42 ℃熱擊 45 s后，于 LB培養(yǎng)基37 ℃孵育4 h，涂布在含有抗性的平板上，并加入X-gal，將平板于37 ℃培養(yǎng)48 h，篩選白色菌落作為陽性質(zhì)粒Bacmid-hPARP1。提取的陽性質(zhì)?？捎糜谙乱徊睫D染實驗。

1.3 Sf9細胞的轉染及其高滴度重組桿狀病毒的獲得

采用Invitrogen公司的脂質(zhì)體轉染試劑將重組質(zhì)粒Bacmid-hPARP1轉染Sf9細胞，操作步驟按照產(chǎn)品說明書進行。每孔 8 μg質(zhì)粒轉染 Sf9細胞4～6 h后更換SF900ⅡSFM，同時轉染空質(zhì)粒，作為陰性對照。6 d后觀察細胞出現(xiàn)病變，收集細胞上清12 000 r/min離心5 min，收集上清并4 ℃避光保存，所獲得的細胞即為P1代。取P1代重組病毒，按照 1∶10稀釋后，感染處于對數(shù)生長期的Sf9細胞，27 ℃培養(yǎng)3 d，細胞出現(xiàn)明顯病變時收集上清，得到 P2代病毒。同樣方法再傳一代，篩選到高滴度的含有hPARP1基因的重組桿狀病毒。用 P3代高滴度的病毒感染細胞48 h、56 h、64 h和72 h后，分別收集病變的細胞。

1.4 hPARP1的Western blotting檢測

收集病變的細胞，用PBS重懸后，超聲裂解細胞，12 000 r/min離心 10 min，上清進行SDS-PAGE電泳，轉膜并用5%的脫脂奶粉封閉后，用鼠抗 hPARP1的一抗 4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST洗滌后，二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG室溫孵育2 h，洗滌后顯色并觀察特異性條帶。

1.5 hPARP1活性測定

1.5.1 NAD+標準曲線的測定

黑色96孔板中加入20 μL NAD，使其終濃度分別為 0.48、0.97、1.95、3.9、7.81、15.625、31.25、62.5、125和250 nmol/L，每個濃度設4個孔。然后加入 10 μL 的 PARP 稀釋緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L MgCl2，pH 8.0)，加入10 μL的2 mol/L KOH和10 μL的20%苯乙酮，4 ℃反應10 min；最后加入45 μL的88%甲酸，110 ℃反應5 min，待板溫度降到常溫時，在激發(fā)波長 (360±15) nm，發(fā)射波長 (445±15) nm條件下[10]測熒光強度。

1.5.2 hPARP1活性的測定

在黑色96孔板中加入20 μL的125 nmol/L NAD+，10 μL不同含量的溶于 PARP緩沖液中hPARP1和DNA (終濃度為15 mg/L) 混合物。反應 15 min后，加入 10 μL 2 mol/L KOH 和 10 μL 20%苯乙酮，4 ℃反應10 min；最后加入45 μL 88%甲酸，110 ℃反應5 min，待板溫度降到常溫時，在激發(fā)波長 (360±15) nm，發(fā)射波長(445±15) nm條件下測熒光強度，同時設置空白對照孔為 20 μL125 nmol/L NAD+，10 μL PARP緩沖液和DNA (終濃度為15 mg/L) 混合物，其hPARP1活性為0%[10-11]。

1.6 hPARP1的純化

1.6.1 3-氨基苯甲酰胺 (3AB) 親和層析柱的合成

用0.5 mol/L NaCl洗滌25 mLECH Sepharose 6B，去除乙醇后，用0.1 mol/L NaOH將其pH調(diào)至 4.5～6.0之間。在 4 ℃條件下，在 ECH Sepharose 6B中緩慢加入 1 g的 EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride) 和 0.5 g 溶于 1 mL甲醇中的 3-氨基苯甲酰胺，搖動過夜，并保持其 pH為4.5～6.0。用 100 mmol/L乙酸鈉 (pH 4.0) 和0.5 mol/L NaCl終止交聯(lián)，并用 100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 和 0.5 mol/L NaCl洗滌填料[12]。

1.6.2 利用 3-氨基苯甲酰胺(3AB)親和層析柱純化hPARP1

12 000 r/min離心5 min，收集Sf9細胞，將其重懸于緩沖液 A (50 mmol/L葡萄糖，0.2%Tween 20，0.5 mmol/L EDTA 和 0.5 mmol/L PMSF)，超聲破碎后12 000 r/min離心30 min，硫酸魚精蛋白 (終濃度1 mg/mL) 去除其DNA，上清液中緩慢加入硫酸銨，使硫酸銨的飽和度達到 70%后，4 ℃靜置 1 h。12 000 r/min離心20 min，用緩沖液 B (100 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，14 mmol/Lβ-巰基乙醇，0.5 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L PMSF) 溶解沉淀。

在層析柱中裝20 mL ECHsepharose 6B-3AB親和填料，并用緩沖液B平衡后，以重力速度流速上樣。用含有 100 mmol/L、400 mmol/L和800 mmol/L NaCl不同濃度的緩沖液B除去樣品中未結合的蛋白，然后用洗脫液 (100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，400 mmol/L NaCl，1 mmol/L 3-甲氧基苯甲酰胺，14 mmol/L β-巰基乙醇，0.5 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L PMSF) 進行洗脫，并收集樣品。

2 結果與分析

2.1 pFast-hPARP1昆蟲表達載體的構建

圖 1 重組質(zhì)粒 pFast-hPARP1雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 1 Identification of recombinant transfer plasmid by enzyme digestion. M: DNA marker; 1: recombinant transfer plasmid digested with Sgf Ⅰand MiuⅠ.

重組質(zhì)粒 pFast-hPARP1是通過將hPARP1基因插入到質(zhì)粒pFastBacTM1的SgfⅠ和MiuⅠ兩個酶切位點間來構建的。獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)SgfⅠ和MiuⅠ雙酶切進行鑒定，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析 (圖1)。通過雙酶切鑒定，理論預測目的片段約為3 045 bp。圖1中泳道2可以看出，質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)2條帶，有一條帶約在3 000 bp處出現(xiàn)，可能對應的是hPARP1基因片段，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送往上海生工生物技術服務有限公司進行測序，測序結果發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒上的hPARP1基因與報道的基因序列完全一致，表明hPARP1基因被正確克隆到質(zhì)粒pFastBacTM1上，可用于下一步的實驗中，將pFast-hPARP1導入E. coliDH10Bac感受態(tài)細胞，發(fā)生轉座后，挑取白色的陽性質(zhì)粒，為Bacmid-hPARP1。

2.2 免疫雜交試驗驗證hPARP1的表達

提取重組質(zhì)粒 (Bacmid-hPARP1) 并轉染Sf9細胞，6 d后可見轉染Bacmid-hPARP1的細胞直徑增大，細胞核充滿整個細胞，細胞發(fā)生病變。將 P3代病毒接種到對數(shù)生長期的 Sf9細胞中，分別在48、56、64和72 h后收集病變細胞。超聲破碎并離心后，取上清將感染細胞和野生病毒感染的 Sf9細胞組分別進行 SDS-PAGE電泳(圖2)，圖2中可在泳道2、3、4、5清晰地看見116 kDa處hPARP的條帶。并利用免疫印跡試驗(Western blotting) 對細胞內(nèi)的hPARP1酶進行結合特異性檢測 (圖3)。從圖3中可以看出，轉染pFast-hPARP1的昆蟲細胞可以與hPARP1抗體發(fā)生特異性反應，而野生病毒感染的Sf9細胞組與hPARP1抗體并無結合反應。免疫印跡結果表明，Sf9昆蟲細胞成功表達hPARP1酶。

2.3 hPARP1活性的測定

2.3.1 NAD+標準曲線的確定

選擇一系列濃度的底物NAD+，按照上述方法測定熒光值，結果顯示 (圖4) 在1 nmol/L時候就可以檢測生成化合物的熒光，當濃度達到250 nmol/L時仍然具有良好的線性關系(R2=0.9984)。根據(jù)標準曲線的測定，選擇熒光值大約一半時的底物濃度，125 nmol/L NAD+作為酶活測定的標準。

圖2 SDS-PAGE檢測昆蟲細胞表達hPARP1Fig. 2 Identification of hPARP1expressed by Sf9 insect cell by Commassie blue staining. 1: Sf9 insect cell transfected with plasmid pFastBacTM1; 2: hPARP1 enzyme expressed in Sf9 insect cell after 48 h; 3:hPARP1 enzyme expressed in Sf9 insect cell after 56 h;4: hPARP1 enzyme expressed in Sf9 insect cell after 64 h; 5: hPARP1 enzyme expressed in Sf9 insect cell after 72 h; 6: protein marker.

圖3 Western blotting分析hPARP1抗體與hPARP1酶的特異性結合Fig. 3 Identification of hPARP1 expressed by Sf9 insect cell by Western blotting. 1: hPARP1 enzyme expressed in Sf9 insect cell identified by Western blotting;2:Sf9 insect cell transfected with plasmid pFastBacTM1.

圖4 NAD+標準曲線Fig. 4 NAD+ calibration curve.

2.3.2 hPARP1活性的測定

hPARP1活性的測定是通過檢測其底物NAD+的量來間接測定hPARP1的活性，NAD+屬于N-烷基吡啶類化合物，其可以與酮類反應，在過量酸中加熱轉化為熒光分子，通過測定熒光值變化間接反應 hPARP1活性。根據(jù)標準曲線，使用125 nmol/L NAD+作為酶活測定的底物，分別加入純化后的不同量的 hPARP1酶和相同 DNA，反應15 min。結果可見圖5，隨著hPARP1量增加，熒光值逐漸降低，說明在相同時間內(nèi)，隨著hPARP1酶濃度的增加，底物NAD+被消耗的越多，即剩余的NAD+越少，熒光值越小。

圖5 hPARP1的活性Fig. 5 Activity of purified hPARP1.

2.4 hPARP1酶的純化

收集病變的細胞，超聲破碎并離心后，利用硫酸魚精蛋白去除 DNA。通過 70%硫酸銨沉淀，一方面富集 hPARP1酶和去除部分雜蛋白(圖6)；另外一方面，通過硫酸銨沉淀使hPARP1酶的比活從 0.051 nmol/(min?μg) 提高到0.072 nmol/(min?μg) (表 1)，純化倍數(shù)提高了 1.4倍，產(chǎn)率為91.5%。

由于 3-氨基苯甲酰胺是 PARP1的抑制劑，它可以與 PARP1的催化結構域特異性結合，所以我們利用 PARP1的這一特點交聯(lián)合成了 3-氨基苯甲酰胺柱，并用它對hPARP1進行純化。首先，用不同濃度的鹽溶液梯度洗除雜質(zhì)，然后用含有3-甲氧基苯甲酰胺的洗脫液進行洗脫，收集液用紫外監(jiān)測儀檢測。純化后的蛋白進行還原性SDS-PAGE分析 (圖6)。如圖6 所示，泳道2中可以清晰觀察到 116 kDa附近有一條很深的條帶，經(jīng)掃描分析，其純度大于90%。結果表明通過利用 hPARP1酶的親和層析柱可以實現(xiàn)hPARP1酶的分離純化，并獲得到較高純度的hPARP1酶蛋白，同時還可以大大提高 hPARP1酶的比活，達到1.988 nmol/(min?μg)。經(jīng)過親和純化后，hPARP1酶的純化倍數(shù)提高了38倍，并且產(chǎn)率仍維持在80%以上。

圖6 SDS-PAGE檢測hPARP1酶的純化Fig. 6 Commassie blue staining of the purified poly(ADP-ribose) polymerase1 from Sf9 lysate. M: protein marker; 1: 3-aminobenzamide affinity chromatography;2: ammonium sulfate precipitation; 3: cleared lysate.

表1 hPARP1純化活性Table 1 hPARP1 activity during the purification

3 討論

近年來，由于 PARP1與炎癥、腫瘤、缺血再灌注等病理過程有著密切的聯(lián)系，PARP1已經(jīng)成為一個新的治療靶點。目前，PARP1抑制劑的篩選已經(jīng)成為抗腫瘤藥物的研究熱點[13-15]，PARP1抑制劑 AZD2281[16]，ABT-888[17]等已經(jīng)進入臨床試驗階段，但是由于其臨床用藥量比預期稍大，臨床試驗陷入了一定的困境[18]，因此，純化出大量高活性的 hPARP1酶有利于我們對PARP1晶體結構的探索，進而增加對PARP這個靶點的認識。同時，高活性及純度的聚 ADP核糖聚合酶在 PARP1抑制劑篩選中的應用具有廣闊的前景。

由于E.coli中有PARP1的水解酶及其蛋白在原核表達系統(tǒng)中的折疊不同[9]，E.coli中表達的有活性的hPARP1的表達量較低，因此我們采用桿狀病毒表達系統(tǒng)。昆蟲表達系統(tǒng)有諸多優(yōu)點，如能進行翻譯后修飾，酶的活性比較穩(wěn)定，產(chǎn)量高，適用性強等[19]。本研究將編碼hPARP1基因重組于桿狀病毒表達載體中，成功構建了能夠表達 hPARP1酶的重組桿狀病毒。Western blotting表明該病毒表達的 hPARP1酶可被hPARP1單克隆抗體識別，表明該系統(tǒng)表達的hPARP1具有免疫原性；酶活測定實驗表明hPARP1有良好的生物活性。

hPARP1酶在體外極不穩(wěn)定，容易降解，其半衰期極短[20]。本研究僅僅利用一個親和層析柱將hPARP1純化，這為工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)提供了可能。純化后的hPARP1酶仍具有良好的生物活性，本研究一方面為 PARP1抑制劑的篩選創(chuàng)造了條件；另一方面，從100 mL的昆蟲細胞中即可純化得到3.2 mg的PARP1酶，表明通過桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn) PARP1酶可以獲得很高的產(chǎn)量，這為大規(guī)模生產(chǎn)hPARP1酶奠定了基礎。同時，大量生產(chǎn) hPARP1酶對我們進一步研究hPARP1的晶體結構，增加對 PARP1的認識提供了必要的條件。

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