丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌體外混合培養(yǎng)對腸道致病菌的影響

浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 張 玲 周 琳 楊彩梅＊

浙江惠嘉生物科技有限公司 曾新福

丁酸梭菌屬于梭菌屬，是一種專性厭氧的革蘭氏陽性芽孢桿菌，其廣泛分布于土壤，也能從健康動物的腸道中分離出來。丁酸梭菌適合動物的腸道厭氧環(huán)境（呼慧娟等，2011），可以控制消化道紊亂（張曉陽等，2012），有效抑制有害菌（曹廣添等，2012）。鼠李糖乳桿菌屬于乳桿菌，具有較強(qiáng)的酸及膽堿耐受能力 （王玉華等，2008），有抑制有害菌的作用 （吳光偉和韓建春，2009），具有抗氧化活性，并且可以影響機(jī)體免疫功能。目前丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌均被廣泛用作飼料添加劑，本試驗(yàn)研究了丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌聯(lián)合培養(yǎng)對產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的抑制作用，為微生物制劑聯(lián)和使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種、試劑及培養(yǎng)基 丁酸梭菌（Clostridium butyricum，HJCB998），由浙江惠嘉生物科技有限公司提供；鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus，ATCC7469)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens，ATCC13124)，均由廣東省微生物菌種保藏中心提供；大腸桿菌C83928（Escherichia coli C83928）、沙門氏菌 （Salmonella gallinarum，C79）、金 黃 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureaus，SHZ018），均由浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院研究室提供。瓊脂、氯化鈉為分析純。厭氧液體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(RCM)、DRCA梭菌選擇性培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB）、 乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基 （MRS）、BP培養(yǎng)基、HE培養(yǎng)基、SC培養(yǎng)基，均購自北京陸橋生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 厭氧培養(yǎng)箱、滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、超凈工作臺、試管、接種環(huán)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 丁酸梭菌活化：將凍干管保藏菌株接種于裝有梭菌液體培養(yǎng)基的試管中，置于厭氧培養(yǎng)基中37℃靜止厭氧培養(yǎng)48 h，取0.1 mL轉(zhuǎn)接裝有9.9 mL厭氧液體培養(yǎng)基的試管，厭氧靜止培養(yǎng)16 h。

產(chǎn)氣莢膜梭菌及鼠李糖乳桿菌活化：在超凈臺內(nèi)，取一定量的無菌水迅速加入打開的凍干管，輕輕將菌粉混勻溶解，然后將菌液分別轉(zhuǎn)接LB斜面及厭氧液體培養(yǎng)基，置37℃厭氧培養(yǎng)48 h后，取1環(huán)菌種接種于裝有9.9 mL厭氧液體培養(yǎng)基的試管，厭氧靜止培養(yǎng)16 h。

1.2.2 培養(yǎng)物的制備 將活化好的0.1 mL丁酸梭菌、鼠李糖乳桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌分別接種于裝有9.9 mL厭氧液體培養(yǎng)基的試管，丁酸梭菌、鼠李糖乳桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌均于37℃厭氧靜止培養(yǎng)24 h，其余腸道致病菌普通培養(yǎng)16 h，并分別計(jì)數(shù)。

1.2.3 混合培養(yǎng) 取16個裝有19.9 mL厭氧液體培養(yǎng)基的三角瓶，將活化的菌液稀釋到104～105cfu/mL，分組混合：（1）丁酸梭菌與大腸桿菌按濃度100∶1比例混合接種到三角瓶中；（2）鼠李糖乳桿菌、大腸桿菌按濃度100∶1比例混合接種到三角瓶中；（3）丁酸梭菌、鼠李糖乳桿菌及大腸桿菌按濃度 100∶100∶1 比例接種至三角瓶中；（4）將等量的大腸桿菌接種于三角瓶中作為對照。隨后置厭氧培養(yǎng)箱中37℃恒溫靜止培養(yǎng)。

活菌計(jì)數(shù)方法：分別在培養(yǎng)的 0、4、8、12、24、36、48、72 h取各組培養(yǎng)物樣本，檢測試驗(yàn)組與對照組中各致病菌的數(shù)量（cfu/mL），并與單獨(dú)培養(yǎng)進(jìn)行對比。采用稀釋平板計(jì)數(shù)法，將待測菌液搖勻，每組分別取0.1 mL樣品進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，選取適當(dāng)稀釋度的菌懸液0.1 mL，分別滴加在伊紅美藍(lán)選擇性培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度3個重復(fù)，置37℃培養(yǎng)48 h后，計(jì)算其菌數(shù)后取平均值（三個平板菌落總數(shù)/3×10×稀釋倍數(shù)）。由于丁酸梭菌、鼠李糖乳桿菌是嚴(yán)格厭氧菌，在有氧情況下無法長出，計(jì)數(shù)結(jié)果為準(zhǔn)確的致病菌菌數(shù)。

丁酸梭菌和鼠李糖乳桿菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的體外生物拮抗作用研究方法同上。選用的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基分別為SC培養(yǎng)基、BP培養(yǎng)基、HE培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌和鼠李糖乳桿菌對沙門氏菌的體外生物拮抗作用 從圖1可以看出，培養(yǎng)12 h時，丁酸梭菌培養(yǎng)組沙門氏菌數(shù)量比沙門氏菌單獨(dú)培養(yǎng)有明顯下降趨勢，菌落數(shù)差別達(dá)2個數(shù)量級，24 h后菌落數(shù)差別達(dá)4～5個數(shù)量級。鼠李糖乳桿菌對沙門氏菌的抑制作用從24 h開始比較明顯，菌落數(shù)差別為1～2個數(shù)量級。丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌混合培養(yǎng)時，沙門氏菌菌落數(shù)從12 h開始明顯下降，24 h后菌落數(shù)差別達(dá)3～4個數(shù)量級，可見，兩種菌聯(lián)合培養(yǎng)對沙門氏菌的抑制無協(xié)同作用。

圖1 丁酸梭菌和鼠李糖乳桿菌對沙門氏菌的體外生物拮抗作用

2.2 丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌對金黃色葡萄球菌的體外生物拮抗作用 從圖2可以看出，丁酸梭菌可以明顯抑制金黃色葡萄球菌，從12 h開始，其菌落數(shù)比金黃色葡萄球菌單獨(dú)培養(yǎng)時下降2～4個數(shù)量級；鼠李糖乳桿菌對金黃色葡萄球菌無明顯抑制作用；丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌混合培養(yǎng)時，從12 h開始，金黃色葡萄球菌菌落數(shù)下降2～3個數(shù)量級，兩菌株混合培養(yǎng)對金黃色葡萄球菌的抑制無協(xié)同作用。

圖2 丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌對金黃色葡萄球菌的體外生物拮抗作用

2.3 丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌的體外生物拮抗作用 從圖3可以看出，丁酸梭菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制作用明顯，從8 h開始，可使菌落數(shù)下降2～5個數(shù)量級，在36 h時抑菌效果最明顯；鼠李糖乳桿菌單獨(dú)作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌時，從12 h開始，可使其菌落數(shù)下降2個數(shù)量級以上；兩菌株聯(lián)合培養(yǎng)對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用在24～48 h時低于丁酸梭菌單獨(dú)培養(yǎng)，其他時間無顯著差異。

圖3 丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌的體外生物拮抗作用

2.4 丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌對大腸桿菌的體外生物拮抗作用 從圖4可以看出，丁酸梭菌能明顯抑制大腸桿菌，從8 h開始，其菌落數(shù)比大腸桿菌單獨(dú)培養(yǎng)時低3～4個數(shù)量級；鼠李糖乳桿菌對大腸桿菌無明顯抑制作用；丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌混合培養(yǎng)時，可以使大腸桿菌菌落數(shù)降低3～4個數(shù)量級，并且抑菌曲線和丁酸梭菌大體一致，表明兩菌株混合培養(yǎng)對大腸桿菌的抑制無協(xié)同作用。

圖4 丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌對大腸桿菌的體外生物拮抗作用

3 討論

丁酸梭菌是腸道正常微生物，可以調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制腸道有害菌。研究表明，丁酸梭菌可以對大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌均產(chǎn)生抑制作 用 （曹 廣 添 等 ，2012；Yang 等 ，2012；Cao 等 ，2012），降低產(chǎn)氣莢膜梭菌在微生物群體中的比例（Kong等，2011）。丁酸梭菌可以產(chǎn)生有機(jī)酸降低腸道pH從而抑制有害菌的生長 (張曉陽等，2012)，同時丁酸梭菌及其脂磷壁酸也可以抑制有害菌在細(xì)胞上的附著（Gao等，2012），另外丁酸梭菌可以減輕艱難梭菌毒素蛋白的毒力并且降低該菌的數(shù)量（Woo等，2011）。本試驗(yàn)表明，丁酸梭菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的生長均有明顯的抑制作用。已有研究表明丁酸梭菌通過產(chǎn)生丁酸、乙酸等短鏈脂肪酸，產(chǎn)生細(xì)菌素，以及對營養(yǎng)物質(zhì)黏附位點(diǎn)的競爭等途徑來抑制有害菌（張曉陽等，2012；Gao 等，2012）。

鼠李糖乳桿菌具有很好的黏附性和抑菌性。Mack等（1999）研究表明，鼠李糖乳桿菌可以體外抑制大腸桿菌，除此之外，鼠李糖乳桿菌對志賀氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、雞白痢沙門菌、腸桿菌、腸球菌等有害菌均有一定的抑制作用（劉冬梅等，2005；魏華等，2001）。 劉冬梅等（2006）研究表明，鼠李糖乳桿菌可以有效抑制有害菌，其抑菌原因主要是產(chǎn)生了乳酸，改變了腸道酸性環(huán)境，對有害菌產(chǎn)生抑制作用。本試驗(yàn)表明，鼠李糖乳桿菌可顯著抑制沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，而對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌無明顯抑制作用，這與之前研究結(jié)果略有不同，其原因有待進(jìn)一步研究。

隨著益生菌制劑在畜牧生產(chǎn)中的大量應(yīng)用，單一益生菌應(yīng)用效果的局限性也慢慢表現(xiàn)出來，因此幾種益生菌的聯(lián)合發(fā)酵和聯(lián)合使用成為益生菌制劑發(fā)展的新趨勢 （馮樹和張忠澤，1990）。Stadie等（2013）研究表明，乳酸菌與酵母菌混合培養(yǎng)，酵母菌釋放精氨酸有助于乳酸菌生長。雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌混合培養(yǎng)時可加快產(chǎn)酸，雙歧桿菌可促進(jìn)嗜酸乳桿菌增殖（張香美等，1999）。丁酸梭菌、腸膜芽孢桿菌、糞腸球菌三種菌的無細(xì)胞上清液彼此之間均有促進(jìn)生長作用 （薛勝平等，2008）。丁酸梭菌與雙歧桿菌體外共培養(yǎng)可以明顯抑制大腸埃希桿菌O157、痢疾桿菌F2a、傷寒桿菌、艱難梭菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長（呂存女等，2011a、b）。丁酸梭菌和嬰兒型雙歧桿菌對霍亂孤菌有拮抗作用，并且其主要拮抗作用是由丁酸梭菌引起的（陸儉等，2000）。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，丁酸梭菌和鼠李糖乳桿菌聯(lián)合培養(yǎng)時對產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均顯示出較強(qiáng)的生物拮抗作用，其中起主要作用的是丁酸梭菌。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，丁酸梭菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的生長均有明顯的抑制作用；鼠李糖乳桿菌可抑制沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，而對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌無明顯抑制作用；丁酸梭菌和鼠李糖乳桿菌聯(lián)合培養(yǎng)時對產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均顯示出較強(qiáng)的生物拮抗作用，但未表現(xiàn)出協(xié)同作用。

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