衍生氣相色譜法測(cè)定甲磺酸伊馬替尼中甲磺酸烷基酯類

連小剛 李孝壁 程紅艷

江蘇豪森醫(yī)藥研究院有限公司，江蘇連云港 222000

甲磺酸伊馬替尼（imatinib mesylate）化學(xué)名稱為4-[（4-甲基-1-哌嗪）甲基]-N-[4-甲基-3-[4-（3-吡啶）-2-嘧啶]氨基]苯基]-苯胺甲磺酸鹽，是一種高效特異的酪氨酸激酶抑制劑[1]。在合成工藝中用到甲醇、異丙醇，片劑生產(chǎn)中用到乙醇溶劑，在生產(chǎn)過程中，有可能與甲磺酸產(chǎn)生具有基因毒性的甲磺酸烷基酯類：甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯[2-3]。

近幾年基因毒性雜質(zhì)成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[4]，甲磺酸、苯甲磺酸等磺酸類物質(zhì)與微量的低級(jí)醇在合成反應(yīng)中生成烷基磺酸酯如甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯（EMS）、異丙基甲磺酸酯（IMS）、正丁基甲磺酸酯（NBMS）[5]，以及芳基磺酸酯如苯磺酸甲酯（MBS）、苯磺酸乙酯（EBS）、對(duì)甲苯磺酸酯（MP-TS），這些物質(zhì)可與DNA發(fā)生烷基化反應(yīng)[6-7]，從而可能成為引發(fā)癌癥的誘因，因此控制藥物中該類雜質(zhì)的毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）水平非常重要[8-9]，歐洲醫(yī)藥評(píng)價(jià)署（EMEA），美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）及國(guó)際藥品注冊(cè)協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）先后對(duì)基因毒性雜質(zhì)做出限度規(guī)定。

由于本品中甲磺酸烷基酯類的限度在中國(guó)藥典沒有規(guī)定，有必要對(duì)樣品中的甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯的殘留量進(jìn)行檢測(cè)，本方法參考?xì)W洲藥典，采用衍生化的方法[10]，通過檢測(cè)碘甲烷、碘乙烷和2-碘丙烷來確定甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸異丙酯的量。

1 儀器與試劑

儀器：電子分析天平，梅特勒XS105；Agilent 7890 GC氣相色譜儀，頂空進(jìn)樣器G1888；安捷倫色譜工作站；色譜柱：ZB-WAX（30m×0.53mm×1.0μm）。試劑：甲醇、丙酮、乙酸乙酯、甲苯、異丙醇均為分析純是國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑股份有限公司。

2 試驗(yàn)過程與結(jié)果

2.1 色譜條件

按照氣相色譜法（中國(guó)藥典2010年版二部 附錄Ⅴ E），用聚乙二醇20M交聯(lián)聚合物為固定相（或極性相似）的毛細(xì)管柱（ZB-WAX 30m×0.53mm×1.0μL），氫火焰離子化（FID）檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度110℃；檢測(cè)器溫度260℃；柱溫40℃維持10min，以每分鐘20℃的升溫速率升至160℃維持3min；頂空瓶平衡溫度為80℃，平衡時(shí)間為30min。取對(duì)照品溶液與供試品溶液分別頂空進(jìn)樣，進(jìn)樣體積3mL，記錄色譜圖，按碘甲烷、碘乙烷、2-碘丙烷的出峰順序；按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

2.2 試驗(yàn)溶液配制

供試品溶液配制：取本品適量，精密稱定，按供試品與乙腈100︰1（mg︰mL）的比例配置供試品溶液，溶液經(jīng)超聲、薄膜過濾處理后，精密移取2mL加入頂空瓶中，加入3mL水、6g碘化鈉后，扎蓋密閉，作為供試品溶液。

對(duì)照品溶液配制：取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯適量，精密稱定，用乙腈制成每毫升含甲磺酸甲酯10μg、甲磺酸乙酯10μg、甲磺酸異丙酯10μg的溶液，精密移取2mL加入頂空瓶中，加入3mL水、6g碘化鈉后，扎蓋密閉，作為對(duì)照品溶液。

2.3 系統(tǒng)專屬性試驗(yàn)

精密稱取甲磺酸甲酯99.2mg、甲磺酸乙酯102.8mg、甲磺酸異丙酯104.8mg分別置100mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，標(biāo)記為 1#、2#、3# 溶液。

分別移取1#、2#、3#溶液各1mL分別置100mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，標(biāo)記為4#、5#、6#液。

分別移取1#、2#、3#溶液各1mL置100mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液，標(biāo)記為7#液。

分別精密移取4#、5#、6#、7#液各2mL分別置入頂空瓶中，并分別加入3mL的水、6g的碘化鈉，扎蓋密閉，分別標(biāo)記為A甲磺酸甲酯衍生化測(cè)試液、B甲磺酸乙酯衍生化測(cè)試液、C甲磺酸異丙酯衍生化測(cè)試液、D對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣A、B、C、D溶液，記錄色譜圖。從表1可見，被測(cè)溶劑各峰的保留時(shí)間與對(duì)照品中各峰保留時(shí)間接近，最小分離度為3.1，符合實(shí)驗(yàn)要求，表明各溶劑的專屬性強(qiáng)，專屬性色譜圖見圖1。

圖1 專屬性氣相色譜圖

表1 專屬性

2.4 定量限與檢測(cè)限

精密稱取甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯適量，置100mL量瓶中，用乙腈溶解制成溶液，作為儲(chǔ)備液。逐步稀釋儲(chǔ)備液，進(jìn)行樣品衍生化，并分別進(jìn)樣至信噪比（峰高/基線噪聲）為3左右為檢測(cè)限，至信噪比為10左右為定量限，結(jié)果見表2。由表2可見，該檢測(cè)方法最小可準(zhǔn)確檢測(cè)0.6ppm的量，表明本方法對(duì)碘甲烷、碘乙烷、2-碘丙烷可以準(zhǔn)確定量檢測(cè)。

表2 定量限與檢測(cè)限

2.5 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密稱取甲磺酸甲酯100.1mg、甲磺酸乙酯103.3mg、甲磺酸異丙酯107.8mg，分別置100mL量瓶中，用乙腈稀釋定容。各移取上述溶液1mL置5mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻表度作為貯備液；分別精密移取貯備液0.3、0.6、0.9、1.2mL分別置于20mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為2#、3#、4#、5#液。移取上述溶液各2mL分別置入頂空瓶中，并分別加入3mL水、6g碘化鈉，扎蓋密閉，平行制備2份。分別進(jìn)樣上述溶液，平行2次進(jìn)樣，取峰面積的平均值與相應(yīng)濃度回歸，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄及線性回歸方程見表3。

表3可見，甲磺酸甲酯在0.0721～12.0μg/mL、甲磺酸乙酯在0.0604～12.4μg/mL、甲磺酸異丙酯0.0679～12.9μg/mL的范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)皆不小于0.999，說明線性良好。線性方程及相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.6 回收率

精密稱取甲磺酸甲酯101.3mg、甲磺酸乙酯100.8mg、甲磺酸異丙酯102.3mg置100mL量瓶，乙腈稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液。取供試品約300mg，置頂空瓶中精密稱定，共稱9份，用儲(chǔ)備液進(jìn)行配置成限量2、30、100ppm的測(cè)試液，置入頂空進(jìn)樣器中，定量測(cè)定的6個(gè)溶劑的平均回收率介于94.1%～111.3%之間，各溶劑回收率的最大相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.79%，表明本方法的準(zhǔn)確性較好。

由表4可見，定量測(cè)定的甲磺酸烷基酯的平均回收率界于94.1%～111.3%之間，回收率的RSD最大為5.79%，表明本方法的準(zhǔn)確性很好。

表4 精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 討論

在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)回收率測(cè)試時(shí)發(fā)現(xiàn)，在衍生化過程中，樣品與碘化鈉也發(fā)生衍生化反應(yīng)，干擾甲磺酸酯的檢測(cè)，影響碘代烷的收率，因此，采用與樣品不溶而與甲磺酸烷基酯易溶的乙腈溶劑，對(duì)樣品中的甲磺酸烷基酯進(jìn)行超聲、萃取。

本研究建立了衍生氣相色譜法測(cè)定甲磺酸伊馬替尼中的基因毒性雜質(zhì)甲磺酸烷基酯類的檢測(cè)方法，該方法專屬性好。對(duì)檢測(cè)限、定量限的測(cè)定，說明此方法具有較高的靈敏度，此外，該方法線性與范圍良好、準(zhǔn)確度好，能對(duì)樣品中的基因毒性雜質(zhì)甲磺酸烷基酯類化合物進(jìn)行很好的控制。

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