DDAH2抑制低氧誘導(dǎo)大鼠心肌細胞H9c2(2-1)凋亡

吳 斌，李旭光，張 玫，羅通行，黃亨建，王蘭蘭*

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗醫(yī)學(xué)科，四川成都610041;2.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海200080)

急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)患者胸痛發(fā)作通常導(dǎo)致心臟血供受阻從而導(dǎo)致心肌缺血再灌注的發(fā)生。心肌缺血/再灌注與心肌細胞凋亡有密切關(guān)系［1－2］;研究亦表明，心肌細胞凋亡是缺血/再灌注損傷發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)之一，然而其具體分子機制目前并不明了［3］。一氧化氮(NO)作為一種重要的胞內(nèi)信使在心肌細胞凋亡中扮演重要的角色［4］。非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)作為體內(nèi)L-精氨酸內(nèi)源性代謝產(chǎn)物能競爭性抑制一氧化氮合酶(NOS)活性，從而減少NO合成［5］;心臟ADMA主要經(jīng)二甲基精氨酸二甲胺水解酶-Ⅱ(Dimethylarginine dimethylamine hydrolase-2，DDAH2)代謝而消除［6］。前期我們已經(jīng)報道DDAH基因與冠心病、腦卒中等發(fā)生存在緊密關(guān)聯(lián)，然而仍然不明確其確切的生物學(xué)機制［7］。目前尚未報道，DDAH2過表達對于心肌細胞的保護作用。本實驗旨在研究過表達DDAH2對于低氧條件下誘導(dǎo)心肌細胞H9c2(2-1)凋亡的影響和是否激活保護性蛋白內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司);大鼠H9c2(2-1)心肌細胞系(中國科學(xué)院上海細胞庫);WST-1細胞毒試劑、轉(zhuǎn)染試劑FuGene HD和PVDF膜(羅氏公司);DDAH2真核細胞表達質(zhì)粒(北京奧潤東源公司);Qiagen Plasmid Endo-free Midi kit(Qiagen公司);AnnexinV-FITC-PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基公司);eNOS抑制劑L-NAME(上海碧云天公司);NOS3(eNOS)抗體、p-NOS3-ser1177抗體和 GAPDH抗體(Santa-cruz公司);DDAH2抗體(Abcam公司)。T75細胞培養(yǎng)瓶和6、12和96孔細胞培養(yǎng)板(NUNC公司)。實驗中所用其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 DDAH2真核細胞表達質(zhì)粒提取與轉(zhuǎn)染

DDAH2真核細胞表達質(zhì)粒為商品化質(zhì)粒，直接前述之方法轉(zhuǎn)染感受態(tài)細胞，行中量提取;按照商品化(轉(zhuǎn)染級)質(zhì)粒中量提取試劑盒之所述方法提取質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染方法為說明書之方法步驟。

1.3 細胞存活率實驗分組與分析(細胞毒實驗)

H9c2(2-1)細胞種植于96孔細胞培養(yǎng)板，待生長至70%匯合度后，即可將培養(yǎng)基更換為含2%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)6 h;隨機分為正常對照(37 ℃，21%O2，5%CO2，74%N2)(ct)組，低氧(37 ℃，5%O2，5%CO2，90%N2)(hy)組，低氧+轉(zhuǎn)染試劑(hy+tr)組，低氧+過表達DDAH2(hy+D)組，每組均設(shè)5個復(fù)孔。正常和低氧細胞培養(yǎng)條件下分別干預(yù)12、24與36 h，以確定最終干預(yù)時間點。完成后，每孔 WST-1溶液加入量為10 μL，置于細胞培養(yǎng)箱30 min，然后在450 nm測定吸光度，該數(shù)值水平反映存活細胞數(shù)量高低。

1.4 Western blot檢測

收集培養(yǎng)時間為36 h的正常對照(ct)組、低氧(hy)組、低氧+轉(zhuǎn)染試劑(hy+tr)組和低氧+過表達DDAH2(hy+D)組等各組心肌細胞，提取總蛋白，Broadford法進行蛋白定量，以每泳道20～25 μg蛋白量上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜裝置置于4℃冰箱、電壓25 V、轉(zhuǎn)膜12 h蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上室溫下脫脂奶粉封閉2.5 h，用一抗DDAH2(1∶1 000～3 000)、p-NOS3 ser1177(1∶2 000)、NOS3(1∶2 000)和GAPDH(1∶2 000)孵育過夜，漂洗3～6次，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊、兔和鼠二抗(1∶5 000)室溫分別孵育2～3 h，曝光顯影成像通過凝膠分析系統(tǒng)，將目的蛋白條帶與相應(yīng)內(nèi)參蛋白條帶吸光度比值的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

1.5 細胞凋亡分組和檢測

H9c2(2-1)細胞種植于12孔細胞培養(yǎng)板，其他同前;隨機分為正常對照(ct)組，低氧(hy)組，低氧+轉(zhuǎn)染試劑(hy+tr)組，低氧+過表達DDAH2(hy+D)組，低氧+過表達DDAH2+L-NAME(hy+D+L)組，每組均設(shè)3個復(fù)孔，干預(yù)時間為36 h。干預(yù)完成后，把細胞培養(yǎng)液吸出至新的1.5 mL離心管內(nèi)，1×PBS洗滌貼壁細胞1次，加入適量胰蛋白酶工作液(含有EDTA)消化細胞。鏡下觀察，若細胞變圓，即可停止消化，加入含有胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中和胰蛋白酶的作用，然后輕輕吹打5～10次，切勿次數(shù)太多。1 000 r/min 5 min，棄掉上清;加入前述中收集的細胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，約 (5～10)×106/L細胞數(shù)，隨 后再次1 000 r/min 5 min，棄上清，收集細胞，用1×PBS輕輕吹打混勻細胞;標(biāo)準(zhǔn)為肉眼可見細胞懸液較為透明;1 000 r/min 5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕吹打細胞。室溫下放置5 min;再加入5 μL Annexin V-FITC溶液，輕輕吹打混勻;室溫避光孵育10 min;1 000 r/min 5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞;加入10 μL PI染色液，輕輕吹打混勻，避光;30 min內(nèi)信號流式細胞儀檢測為宜，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低氧培養(yǎng)大鼠心肌細胞存活水平分析

低氧條件下培養(yǎng)心肌細胞轉(zhuǎn)染DDAH2基因12、24和36 h后(同時維持低氧狀態(tài))，檢測其細胞存活水平。預(yù)實驗結(jié)果顯示，低氧培養(yǎng)36 h各個分組細胞存活水平差異較大，最終選擇低氧培養(yǎng)心肌細胞為36 h。低氧作用36 h細胞存活率顯著性低于對照組(P＜0.05);而過表達DDAH2與低氧培養(yǎng)共同作用下心肌細胞存活率顯著性高于低氧組與低氧+轉(zhuǎn)染試劑組(P＜0.05)(圖1)。

圖1 WST-1法細胞毒性檢測低氧培養(yǎng)心肌細胞相對存活水平Fig 1 Relative survival levels of cultured myocardial cells in hypoxia by WST-1 assay

2.2 低氧培養(yǎng)大鼠心肌細胞DDAH2基因過表達

低氧培養(yǎng)心肌細胞36 h顯著性抑制DDAH2蛋白表達(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染DDAH2真核表達質(zhì)粒能夠顯著性提高心肌細胞的DDAH2表達水平(P＜0.05)，而僅僅加入轉(zhuǎn)染試劑并不能改變低氧下心肌細胞的DDAH2的低表達(圖2)。

圖2 低氧培養(yǎng)心肌細胞DDAH2基因過表達Fig 2 DDAH2 overexpression in hypoxia cultured cardiomyocytes

2.3 低氧培養(yǎng)大鼠心肌細胞eNOS磷酸化水平分析

低氧下心肌細胞eNOS磷酸化水平明顯下調(diào)(P＜0.05)，過表達DDAH2可以顯著性上調(diào)低氧下心肌細胞的eNOS磷酸化水平(P＜0.05)(圖3)。

圖3 過表達DDAH2上調(diào)低氧下心肌細胞eNOS磷酸化Fig 3 Up-regulation of phosphorylation of eNOS by overexpression-DDAH2 in hypoxia

圖4 L-NAME抑制DDAH2對低氧下心肌細胞的拮抗凋亡作用Fig 4 L-NAME inhibits anti-apoptotic effect of DDAH2 in hypoxia cultured H9c2(2-1)cells

2.4 過表達DDAH2對低氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細胞凋亡的影響與eNOS的關(guān)系

低氧作用36 h心肌細胞凋亡率為27.34% ±1.33%，顯著高于對照組(8.76% ±0.77%)(P＜0.05);DDAH2過表達組心肌細胞凋亡率為17.38% ±1.52%，顯著性低于低氧組(P＜0.05)，而L-NAME能夠明顯地阻斷過表達DDAH2的保護作用(圖4)。

3 討論

現(xiàn)已明確機體NO水平和NOS活性的高低是由 DDAH-ADMA-NOS 通路來共同調(diào)節(jié)［8－9］。DDAH存在兩個亞型:DDAH1和DDAH2。DDAH1主要分布于表達神經(jīng)型 NOS的組織(大腦、腎臟)，而DDAH2主要分布于表達內(nèi)皮型NOS的組織(血管、心臟)［10］。

前面已經(jīng)提到急性冠脈綜合征、急性心肌梗死等轉(zhuǎn)歸都與缺血/再灌注所致?lián)p害緊密相關(guān)。研究顯示NO是缺血/再灌注所導(dǎo)致微循環(huán)紊亂并改善的關(guān)鍵分子;通過上調(diào)DDAH1基因的表達能夠顯著改善缺血/再灌注對于肝臟帶來的氧化應(yīng)激損害［11］。ADMA作為內(nèi)源性的一氧化氮合酶抑制性分子早已為人所知［12］。ADMA在人體內(nèi)主要有蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生，但是卻由DDAH1和DDAH2代謝排出體外［13］，據(jù)此可以認(rèn)為體內(nèi)ADMA代謝水平高低和NO水平受到DDAH的調(diào)節(jié)。研究表明DDAH轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為DDAH的組織活性和表達水平增加，血漿ADMA的水平下降，血漿和尿液中NO的水平上升［14］。以上研究均提示，NOS-NO通路的活化受到上游DDAH-ADMA通路來調(diào)節(jié)。一般情況下，健康的Wistar大鼠心臟，DDAH表達水平較低，DDAH2與內(nèi)皮細胞和內(nèi)膜eNOS的分布一致。主動脈結(jié)扎所致缺血/再灌注的Wistar大鼠(發(fā)生心肌梗死)左心室心肌組織DDAH活性明顯升高;梗死周邊心肌細胞可以被檢測出DDAH1和DDAH2蛋白，此外，梗死區(qū)域浸潤的炎癥細胞和微血管周圍DDAH2活性亦增加［15］。

本研究采用體外低氧條件培養(yǎng)誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，觀察轉(zhuǎn)染DDAH2真核細胞表達質(zhì)粒的心肌細胞凋亡水平的變化以及eNOS蛋白磷酸化，結(jié)果是轉(zhuǎn)染DDAH2基因后低氧所誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡明顯降低;eNOS蛋白磷酸化水平上調(diào)，而抑制eNOS顯著性降低DDAH2的保護作用，提示可能抑制DDAH2可能是在低氧下通過誘導(dǎo)eNOS活化來保護心肌細胞。但是DDAH2基因過表達保護心肌細胞的深入的分子信號機制并不明確，在下一步將進行更具體的研究和探索。

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