溶血磷脂酸調(diào)控RhoA/ROCK2信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

許 海，段剛峰

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)黃家湖醫(yī)院婦科，湖北武漢430065;2.武漢市第一醫(yī)院，湖北武漢430022)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在西方國(guó)家穩(wěn)居女性惡性腫瘤之首，在我國(guó)近年來(lái)也呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命。Rho家族蛋白及其下游重要的信號(hào)靶蛋白R(shí)ho激酶2(Rho-associated kinase，ROCK2)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)方面均有聯(lián)系，包括腫瘤的生長(zhǎng)和增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移細(xì)胞凋亡等，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要指標(biāo)［1］。RhoA/ROCK2信號(hào)通路已證實(shí)參與了乳腺癌的發(fā)生［2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的磷脂，作為細(xì)胞間信號(hào)分子，也與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3］，但二者之間的關(guān)系對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖鮮有報(bào)道。本研究試圖闡述溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)、RhoA/ROCK2信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制，以期為乳腺癌的臨床治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞 (上海富眾生物科技發(fā)展有限公司);兔抗 RhoA單克隆抗體及羊抗人Rock2(C-20)多克隆抗體 (CST公司);RhoA活性檢測(cè)試劑盒 (Cytoskeleton公司);ROCK特異性抑制劑Y-27632(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司);牛血清白蛋白 (BSA)(Sigma公司);L-15培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)液、新生牛血清 (武漢子心生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):MDA-MB-435細(xì)胞復(fù)蘇后將其接種于L-15培養(yǎng)基(含10%新生牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)中，并于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。然后接種于6孔板中，細(xì)胞1×105個(gè)/孔，同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖能力實(shí)驗(yàn):1)LPA對(duì)癌細(xì)胞的增殖作用:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞1×104個(gè)/孔，PBS沖洗，分別加入濃度為 1、5、20 和50 μmol/L的 LPA(含無(wú)血清的1640培養(yǎng)液)，連續(xù)4 d于24、48、72和96 h收集細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)1次，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。2)Y-27632對(duì)LPA促增殖活性的影響:將上述培養(yǎng)后單細(xì)胞懸液隨機(jī)分為對(duì)照組、觀察組及抑制組。①對(duì)照組:在37℃、5%CO2條件下，以10%新生牛血清的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)。②觀察組:選擇最佳促增殖濃度50 μmol/L LPA+10%新生牛血清的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)。③50 μmol/L LPA+10%新生牛血清的L-15培養(yǎng)基 +10 μmol/L Y-27632培養(yǎng)，處理24 h后，靜置30 min后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。3)RhoA活性測(cè)定 離心收集上述細(xì)胞，重懸于50 mL的低鹽結(jié)合緩沖液中，超聲裂解，10 000×g離心10 min，取上清，LSAB洗3次后，置于4℃緩慢搖動(dòng)2 h并保存;取細(xì)胞懸液30 μL加入500 μL低鹽結(jié)合緩沖液中，4℃緩慢搖動(dòng)1 h，清洗棄上清，以Pull-down法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)RhoA活性，具體操作步驟依照Cytoskeleton提供的RhoA活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Western blot檢測(cè)RhoA-GTP的表達(dá)，RhoA-GTP/總RhoA代表 RhoA活性。4)Western blot檢測(cè)RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)用RIPA緩沖液200 μL裂解上述細(xì)胞，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)印和封閉后，分別加入RhoA單克隆抗體及Rock2(C-20)多克隆抗體，4℃過(guò)夜，加入生物素標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，室溫下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠(內(nèi)含EB)電泳，成像系統(tǒng)照像，吸光度比值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件處理所有數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LPA對(duì)MDA-MB-435細(xì)胞增殖的影響

LPA可以顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，并呈時(shí)間與劑量依賴性關(guān)系(P＜0.05)，但LPA濃度為20 μmol/L與50 μmol/L對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)顯著差異(圖1)。

2.2 ROCK 抑制劑Y-27632對(duì)LPA促增殖活性的影響

LPA可以顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖(P＜0.05)，ROCK抑制劑Y-27632可以顯著抑制LPA對(duì)癌細(xì)胞的增殖活性(P＜0.05)(圖2)。

2.3 各組細(xì)胞內(nèi)RhoA活性比較

經(jīng)LPA干預(yù)后，觀察組RhoA活性較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P＜0.01);給予ROCK抑制劑后，抑制組RhoA活性較觀察組顯著降低(P＜0.05)，但仍略高于對(duì)照組(P＜0.05)(圖3)。

圖3 各組細(xì)胞內(nèi)RhoA活性比較Fig 3 RhoA activity of each group

2.4 各組細(xì)胞內(nèi)RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)

觀察組的RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P＜0.05);抑制組RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)較觀察組顯著降低(P＜0.05)，但仍略高于對(duì)照組(P ＜0.05)(圖4，表1)。

圖4 RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)電泳圖Fig 4 Electrophoresis map of RhoA and ROCK2 protein expression

表1 各組細(xì)胞內(nèi)RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)比較Table 1 Comparison of RhoA and ROCK2 expression

3 討論

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性程度的關(guān)鍵指標(biāo)之一，細(xì)胞的黏附行為及細(xì)胞表面的蛋白水解酶活性直接決定著腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移特征［4］。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，人們對(duì)于乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，特別是對(duì)乳癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的研究有了突破性的進(jìn)展，由此開(kāi)展的生物治療在該病的治療中也取得了令人矚目的成績(jī)。

LPA是一種對(duì)多種細(xì)胞具有不同生物學(xué)活性的磷脂介質(zhì)，在組織中廣泛存在，臨床研究發(fā)現(xiàn)，LPA具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和耐藥等生物學(xué)效應(yīng)，其存在大大加劇了卵巢癌、子宮癌、及乳腺癌等婦科癌癥的惡性化程度［5］。另外，LPA還能夠通過(guò)刺激 Akt磷酸化、激活 NF-κB抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡［6］。LPA可能通過(guò)Rho/Rock信號(hào)通路而上調(diào)宮頸癌HeLa細(xì)胞的遷移和黏附［7］。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，Rho/Rock信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用［8］。RhoA是 Rho/Rock信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子，它通過(guò)激活其下游靶分子-Rock，在細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生，細(xì)胞極性，細(xì)胞遷移等多個(gè)方面發(fā)揮了重要的作用，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種行為與功能，包括收縮、游走、黏附、生長(zhǎng)分裂以及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與浸潤(rùn)等，參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，是近年的研究熱點(diǎn)之一［9］。研究表明，RhoA作為一種癌基因，在許多腫瘤中都高表達(dá)［10］。有資料顯示，Rho蛋白家族與乳腺癌的發(fā)生有相關(guān)性，RhoA分子在乳腺癌中表達(dá)增高，并且與乳腺癌的惡性表型相關(guān)［11］。

本研究中表1顯示，隨著LPA濃度的增加、時(shí)間的增加，人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖也隨之增加，說(shuō)明，LPA以劑量依賴性、時(shí)間依賴性的方式顯著促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，但LPA濃度為20 μmol/L與50 μmol/L對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)顯著差異。表2顯示，當(dāng)使用ROCK抑制劑Y-27632后，抑制組MDA-MB-231的增殖顯著低于觀察組，提示ROCK抑制劑Y-27632可以顯著抑制LPA對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖。由于LPA是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)能通過(guò)跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體 (gprotein2coupled receptors，GPCRs)的 Gα亞單位激活RhoA的物質(zhì)，RhoA通過(guò)效應(yīng)物ROCK促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生收縮力以促進(jìn)細(xì)胞增殖［12］，同時(shí)說(shuō)明 LPA可能是通過(guò)Rho/Rock信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。另外，從圖3我們可以看出，經(jīng)LPA干預(yù)后，觀察組RhoA活性顯著強(qiáng)于對(duì)照組;當(dāng)給予ROCK抑制劑后，抑制組RhoA活性則顯著低于觀察組。圖4則說(shuō)明觀察組由于LPA的刺激，其RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增強(qiáng);抑制組由于抑制劑Y-27632的干預(yù)，RhoA、ROCK2蛋白表達(dá)較觀察組顯著降低。結(jié)果提示，LPA在促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖的同時(shí)，也增強(qiáng)了RhoA的活性，上調(diào)了RhoA、ROCK2的蛋白表達(dá)，由此推測(cè)，LPA與RhoA/ROCK2信號(hào)通路都參與了乳腺癌細(xì)胞的增殖，與文獻(xiàn)報(bào)道一致;LPA可能通過(guò)Rho/Rock信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，LPA可能通過(guò)調(diào)控RhoA/ROCK2信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，為乳腺癌的臨床治療提供了新思路。

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