LATS2基因在上皮性卵巢癌中的表達(dá)和臨床意義

雷 靜，萬 霖，李惠新

(蘭州大學(xué)1.第二臨床醫(yī)學(xué)院;2.第二醫(yī)院婦科，甘肅蘭州730000)

卵巢癌是臨床上死亡率最高、預(yù)后最差的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制與原癌基因的激活及抑癌基因的突變、缺失等密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)染色體13q11-q12區(qū)域的基因雜合性損傷及缺失與多種原發(fā)性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［1］。LATS2基因定位于13q11-q12，編碼絲/蘇氨基酸蛋白激酶，定位于中心體，主要負(fù)責(zé)積累γ-微管蛋白和紡錘體的形成，通過調(diào)控細(xì)胞周期而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［2－3］。隨著對(duì)LATS2基因的廣泛研究發(fā)現(xiàn)與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。目前關(guān)于LATS2基因與卵巢癌關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。上皮性卵巢癌是最常見的類型，為此我們收集上皮性卵巢癌組織，采用SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化法檢測上皮性卵巢癌組織中LATS2基因的mRNA和蛋白的表達(dá)情況，分析其與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本及臨床資料

組織標(biāo)本均來自于蘭州大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科(漿液性囊腺癌13例，黏液性囊腺癌7例，漿液性囊腺瘤10例，正常卵巢組織10例)，并經(jīng)過患者及家屬的口頭知情同意。石蠟切片來源于蘭州大學(xué)第二醫(yī)院病理科，共110例(上皮性卵巢癌58例，漿、黏液性囊腺瘤共30例，正常組織22例)，所有患者均未接受放、化療，臨床病例資料完整。

1.2 主要試劑

RNAiso Plus、cDNA和SYBR Green PCR試劑等(TaKaRa公司)，引物(大連寶生物公司)，LATS2引物序列:上游:5'-GCTTCATCCACCGAGACATCAA-3'，下 游:5'-CGACAGTTAGACACATCATCCCAGA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為198 bp;內(nèi)參基因β-actin引物序列:上游:5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游:5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為196 bp。兔抗人LATS2多克隆抗體(博奧森生物)，免疫組化所需試劑(北京中杉金橋公司)。

1.3 RT-PCR

按試劑盒說明操作，反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL RT-PCR產(chǎn)物于2.5%瓊脂凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描。

1.4 SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR

按Two Step RNA PCR試劑盒說明操作，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s及60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán);95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。采用 2－△△Ct法對(duì)LATS2基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.5 免疫組化

按試劑盒說明書操作。LATS2蛋白陽性染色定位于胞質(zhì)，DAB染色后出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用雙盲法隨機(jī)選擇10個(gè)具有代表意義的高倍視野(×200)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞取平均數(shù)作為本病例的最終的結(jié)果。以陽性細(xì)胞數(shù)所占比例分為:10%(－)，11% ～29%(+)，30% ～50%(++)，＞50%(+++);染色強(qiáng)度判定:不著色(－)，淺棕黃色(+)，棕黃色(++)，棕褐色(+++)，根據(jù)4個(gè)等級(jí)得出LATS2表達(dá)的評(píng)分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析3組間的表達(dá)差異;兩兩比較采用秩和檢驗(yàn);LATS2與臨床病理特征間的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 LATS2 mRNA的表達(dá)

惡性組、良性組及正常卵巢組織中均有LATS2表達(dá)，并確定為目的條帶(圖1);SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR顯示 LATS2的熔解曲線為單一峰型，LATS2擴(kuò)增曲線基本平行(圖2)。LATS2在卵巢癌中的表達(dá)量為正常卵巢組織中的0.084倍(P＜0.001)、良性卵巢腫瘤的 0.208倍(P＜0.01)(表1)。

圖1 LATS2及其內(nèi)參在不同卵巢癌組織中的表達(dá)情況Fig 1 The expression of LATS2 mRNA in different ovarian cancer

表1 不同組卵巢組織中LATS2的表達(dá)Table 1 Expression of LATS2 mRNAin different ovarian tissue

圖2 LATS2產(chǎn)物的溶解曲線Fig 2 Melting curves of LATS2

2.2 LATS2表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系

LATS2在上皮性卵巢癌中、高分化組的表達(dá)量高于低分化組(P＜0.05)，在Ⅰ、Ⅱ期的陽性表達(dá)量高于Ⅲ、Ⅳ期上皮性卵巢癌組織(P＜0.01)，有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)(表2)。

表2 LATS2在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)與臨床及病理特征之間的關(guān)系Table 2 Relationship between the expression of LATS2 mRNAin epithelial ovarian cancer tissue and the clinicopathological characteristics

2.3 LATS2蛋白的表達(dá)

LATS2的特異性染色主要存在于上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，極少見于核內(nèi)(圖3，4，5)。惡性組、良性組及正常組中的LATS2的陽性表達(dá)率存在明顯差異(P＜0.01)。惡性組的LATS2表達(dá)水平低于良性組(P＜0.01)和正常組(P＜0.001)(表3)。

圖5 LATS2在卵巢癌組織中的表達(dá)Fig 4 The express of LATS2 protein in ovarian cancer tissue(×200)

表3 不同組中LATS2的表達(dá)情況Table 3 Expression of LATS2 protein in different ovarian tissue

2.4 LATS2表達(dá)下調(diào)或缺失與臨床病理特征之間的關(guān)系

LATS2在上皮性卵巢癌中、高分化組的陽性表達(dá)率顯著高于低分化組(P＜0.01)，在Ⅰ、Ⅱ期的陽性表達(dá)率則顯著高于Ⅲ、Ⅳ期上皮性卵巢癌組織(P＜0.001)，有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.01)(表4)。

3 討論

本研究PCR結(jié)果顯示LATS2在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)量均低于良性組和正常組，這與其他腫瘤中的表達(dá)情況類似。LATS2在乳腺癌組織中明顯低于正常組織，同時(shí)在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中的LATS2 mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)，且與其啟動(dòng)子高甲基化有關(guān)［4－5］。同樣在急性淋巴細(xì)胞白血病中也發(fā)現(xiàn)LATS2 mRNA低表達(dá)與啟動(dòng)子高甲基化有關(guān)，并與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，提示LATS2低表達(dá)可能與其啟動(dòng)子高甲基化相關(guān)［6－7］。在惡性間皮瘤、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中也檢測到LATS2表達(dá)下調(diào)［8－9］。此外，免疫組化結(jié)果顯示LATS2在正常卵巢組織均為陽性表達(dá)，而在上皮性卵巢癌中存在的表達(dá)缺失，達(dá)(25/58)43.1%，提示LATS2的缺失有可能成為鑒別正常卵巢和上皮性卵巢癌的標(biāo)記，為卵巢癌的早期診斷提供依據(jù)。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LATS2蛋白的表達(dá)主要位于胞質(zhì)，此結(jié)果與來自鼻咽癌的研究并不一致，LATS2在鼻咽癌組織中為高表達(dá)，LATS2高表達(dá)的鼻咽癌患者預(yù)后差，且LATS2主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞核［10］。這可能是因?yàn)楸茄拾┮环N與EBV感染有關(guān)的特殊頭頸部惡性腫瘤，而具體的病因目前尚無統(tǒng)一定論，有待進(jìn)一步深入研究。二者結(jié)果的不同提示LATS2在腫瘤發(fā)生中的作用具有組織特異性。

表4 LATS2在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)與臨床及病理特征之間的關(guān)系Table 4 Relationship between the expression of LATS2 protein in epithelial ovarian cancer tissue and the clinicopathological characteristics

結(jié)合臨床病理資料，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示LATS2基因的表達(dá)與年齡及病理類型無關(guān)。而上皮性卵巢癌的惡性程度越高，LATS2的表達(dá)量越低，提示了LATS2的高表達(dá)可以作為一種預(yù)后佳的標(biāo)志。進(jìn)一步分析LATS2的表達(dá)水平與卵巢癌患者的臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LATS2的低表達(dá)水平與卵巢癌的病理分期、分化級(jí)別及轉(zhuǎn)移等情況也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。提示LATS2可能會(huì)參與抑制卵巢癌進(jìn)一步惡化及轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能發(fā)生在LATS2基因序列的上游調(diào)節(jié)或其轉(zhuǎn)錄水平。

總之，本研究對(duì)LATS2的mRNA和蛋白表達(dá)水平與卵巢癌的關(guān)系做了初步研究，證實(shí)了LATS2的表達(dá)水平與卵巢癌的發(fā)生、惡性程度等呈負(fù)相關(guān)趨勢。并為卵巢癌病情發(fā)展的預(yù)測的提供了分子水平的理論依據(jù)。

［1］Yabuta N，Okada N，Ito A，et al．Lats2 is an essential mitotic regulator required for the coordination of cell division［J］．J Biol Chem，2007，282，19259－19271．

［2］Collinet P，Vereecque R，Sabban F，et al．In vivo expression and antitumor activity of p53 gene transfer with naked plasmid DNA in an ovarian cancer xenograft model in nude mice［J］．J Obstet Gynaecol Res，2006，32，449 －453．

［3］Toji S，Yabuta N，Hosomi T，et al．The centrosomal protein Lats2 is a phosphorylation target of Aurora-A kinase［J］．Genes Cells，2004，9，383 －397．

［4］Takahashi Y，Miyoshi Y，Takahata C，et al．Down-regulation of LATS1 and LATS2 mRNA expression by promoter hypermethylation and its association with biologically aggressive phenotype in human breast cancers［J］．Clin Cancer Res，2005，11，1380 －1385．

［5］Takahashi Y，Miyoshi Y，Morimoto K，et al．Low LATS2 mRNA level can predict favorable response to epirubicin plus cyclophosphamide，but not to docetaxel，in breast cancers［J］．J Cancer Res Clin Oncol，2007，133，501 －509．

［6］Kawahara M，Hori T，Chonabayashi K，et al．Kpm/Lats2 is linked to chemosensitivity of leukemic cells through the stabilization of P73［J］．Blood，2008，112，3856 －3866．

［7］ Jimenez-Velasco A，Roman-Gomez J，Agirre X，et al．Downregulation of the large tumor suppressor 2(LATS2/KPM)gene is associated with poor prognosis in acute lymphoblastic leukemia［J］．Leukemia，2005，19，2347 －2350．

［8］Murakami H，Mizuno T，Taniguchi T，et al．LATS2 is a tumor suppressor gene of malignant mesothelioma［J］．Cancer Res，2011，71，873 －883．

［9］Jiang Z，Li X，Hu J，et al．Promoter hypermethylation-mediated down-regulation of LATS1 and LATS2 in human astrocytoma［J］．Neurosci Res，2006，56，450 －458．

［10］Zhang Y，Hu C．F，Chen J，et al．LATS2 is de-methylated and overexpressed in nasopharyngeal carcinoma and predicts poor prognosis［J］．BMC Cancer，2009，9，358．dio:10.1186/1471－2407－9－385．