重組人粒細(xì)胞集落刺激因子促進(jìn)兔手術(shù)聯(lián)合化療后的切口愈合

徐 鯤，楊 敏，孫 靜，閆 榮，呂寶玉

(1.山東大學(xué)護(hù)理學(xué)院，山東濟(jì)南250012;2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，山東濟(jì)南250012;3.山東中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，山東濟(jì)南250355;4.山東省腫瘤醫(yī)院，山東濟(jì)南250117)

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，手術(shù)聯(lián)合化療在臨床上已廣泛應(yīng)用?；熼_(kāi)始越早，越有利于殺滅殘存的腫瘤細(xì)胞，防止擴(kuò)散。既往因擔(dān)心化療影響術(shù)后切口愈合，多在切口拆線后進(jìn)行化療，從而耽擱化療開(kāi)始時(shí)間。因此，如何使用手術(shù)聯(lián)合化療而又不會(huì)對(duì)切口愈合造成太大的影響成為臨床上亟需解決的問(wèn)題。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)是一種具有多項(xiàng)潛能的造血生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞趨向缺血組織，促進(jìn)血管新生和損傷血管的復(fù)內(nèi)皮化，而且對(duì)其他細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及皮膚黏膜細(xì)胞等具有刺激生長(zhǎng)作用［1］。將該藥應(yīng)用于促進(jìn)手術(shù)聯(lián)合化療后的切口愈合，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)切口愈合作用的影響及對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)的影響，為今后臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)新西蘭大白兔24只，雌雄各半，體質(zhì)量1.90～2.30 kg［山東省西嶺角種兔繁殖中心，許可證號(hào):SCXK(魯)20090013］;欣粒生(北京四環(huán)生物制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào):2010 0110)。

1.2 大白兔手術(shù)切口模型制備及給藥

用靜脈注射地西泮(0.7 mg/kg)，腹腔注射氯胺酮(40 mg/kg)聯(lián)合麻醉兔后，常規(guī)手術(shù)制作切口模型，取無(wú)菌刀切開(kāi)腹部皮膚、筋膜層，暴露腹膜層后逐層縫合。

將兔隨機(jī)分為3組，每組8只?？瞻捉M(normal)8只，單純進(jìn)行手術(shù)，每天常規(guī)切口處換藥兩次;對(duì)照組(control)8只，手術(shù)前當(dāng)日給予表阿霉素靜脈輸注，每天常規(guī)切口處換藥兩次;治療組(treatment)8只，手術(shù)前當(dāng)日給予表阿霉素靜脈輸注，每日兩次切口換藥時(shí)涂抹重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。

1.3 觀察指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 切口感染:判定標(biāo)準(zhǔn)按照外科學(xué)分為:甲級(jí)愈合，乙級(jí)愈合和丙級(jí)愈合。感染率為(乙級(jí)愈合+丙級(jí)愈合)/(甲級(jí)愈合+乙級(jí)愈合+丙級(jí)愈合)×100%。

1.3.2 3組均于手術(shù)后第7天取切口部位組織:常規(guī)病理切片，HE染色。按照病理感染程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)感染(0級(jí)):切片內(nèi)為肉芽組織;輕度感染(Ⅰ級(jí)):有少量中性白細(xì)胞彌散浸潤(rùn)，感染壞死面積小于切片面積的10%;中度感染(Ⅱ級(jí)):有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，感染壞死面積大于10%，小于30%;重度感染(Ⅲ級(jí)):有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，感染壞死面積大于30%。

1.3.3 免疫組化法檢測(cè)VEGF:每張切片在200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察切口組織VEGF計(jì)數(shù)陽(yáng)性表達(dá)率，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為(-)，陽(yáng)性細(xì)胞比率＜25%為(+)，25% ～50%為(++)，50% ～75%為(+++)，＞75%為(++++)。

1.3.4 手術(shù)后第7天，耳源靜脈采血，使用酶聯(lián)免疫吸附法觀察腫瘤壞死因子α(α-tumor necrosis factor，TNF-α)水平。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)測(cè)量值進(jìn)行記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組切口愈合感染

各組手術(shù)后第1天均見(jiàn)切口處結(jié)痂。其后，空白組4例見(jiàn)創(chuàng)面少許滲出物并逐漸干燥，第8天A級(jí)愈合，4例局部滲液較多，輕微紅腫，換藥處理后第8天B級(jí)愈合，感染率50%;對(duì)照組5例局部滲液較多，紅腫，第8天B級(jí)愈合，3例分別于第4、5和5天出現(xiàn)切口化膿，經(jīng)局部引流，第10天C級(jí)愈合，感染率100%;治療組3例第8天A級(jí)愈合，5例見(jiàn)局部滲液增多，有紅腫，第8天B級(jí)愈合，感染率63%?？瞻捉M與治療組均低于對(duì)照組(P＜0.05)(表1)。

表1 3組手術(shù)切口愈合情況比較Table 1 Comparative wound healing of three groups after operation(n=8)

圖1 3組病理HE染色圖片F(xiàn)ig 1 Pathologic pictures in three groups by HE staining(×100)

第7天手術(shù)切口病理檢查(圖1)，空白組可見(jiàn)肉芽組織生長(zhǎng)旺盛，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列緊密，毛細(xì)血管增生明顯，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，局部感染壞死;對(duì)照組可見(jiàn)毛細(xì)血管內(nèi)皮不完整，局部組織結(jié)構(gòu)不清，可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，片狀壞死組織較多;治療組見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞核分裂象增多，毛細(xì)血管明顯增多，可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，但壞死組織面積少。對(duì)照組明顯重于空白組和治療組(P＜0.05)(表2)。

2.2 各組免疫組化VEGF表達(dá)

病理免疫組化(圖2)，可見(jiàn)VEGF在表皮細(xì)胞、皮脂腺上皮細(xì)胞、毛囊上皮細(xì)胞和部分血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒，為陽(yáng)性表達(dá)。治療組陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯高于空白組和對(duì)照組(P＜0.05)(表3)。

表2 3組病理感染程度檢查結(jié)果Table 2 Pathologic result on infection in three groups(n=8)

表3 3組VEGF免疫組化水平Table 3 Immunohistochemistry in three group of VEGF(n=8)

圖2 3組VEGF免疫組化Fig 2 Expression of VEGF in three groups by immunohistochemistry(HE×200)

2.3 各組TNF-α水平

TNF-α 水平(表4)，空白組17.73±7.21 ng/L、對(duì)照組9.79±4.31 ng/L、治療組11.69±4.45 ng/L，治療組雖高于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異。

表4 3組外周靜脈血中TNF-α水平Table 4 TNF-α levels in peripheral vein serum of rabbit( ±s，ng/L，n=8)

表4 3組外周靜脈血中TNF-α水平Table 4 TNF-α levels in peripheral vein serum of rabbit( ±s，ng/L，n=8)

group TNF-α normal 17.73±7.21 control 9.79±4.31 treatment 11.69±4.45

3 討論

切口愈合過(guò)程主要分3個(gè)階段:炎性反應(yīng)階段、細(xì)胞增殖階段及結(jié)締組織形成階段和塑造階段。切口刺激的組織級(jí)聯(lián)反應(yīng)主要包括血管和組織細(xì)胞的炎性反應(yīng)、細(xì)胞的遷移、增殖和分化、血管和上皮形成、纖維增生和組織重建過(guò)程［2］。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性的有絲分裂原，也是一種有效的血管形成和血管通透性誘導(dǎo)因子。John Christoforidis等［3］使用抗VEGF的藥物進(jìn)行切口愈合的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，使用抗VEGF藥物后第7天切口部位新生血管明顯少于不使用藥物的對(duì)照組;有研究表明，敲除了白介素12/23的小鼠在傷口愈合時(shí)其VEGF表達(dá)明顯升高，從而能使愈合加快［4］。rhG-CSF是利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的人粒細(xì)胞集落刺激因子，具有動(dòng)員血管內(nèi)皮祖細(xì)胞趨向缺血組織，促進(jìn)血管新生作用，而且對(duì)成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、皮膚黏膜細(xì)胞等具有刺激生長(zhǎng)作用。本實(shí)驗(yàn)，通過(guò)局部外用rhG-CSF，可見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞核分裂象增多，增生旺盛，真皮層毛細(xì)血管明顯增多，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，支持rhG-CSF具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用和促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化降低局部感染程度作用。同時(shí)，用免疫組化方法測(cè)定兔手術(shù)切口處組織中的VEGF表達(dá)以明確rhG-CSF是否通過(guò)提高VEGF的水平，達(dá)到促進(jìn)切口愈合目的。結(jié)果表明，rhG-CSF局部外用，可以明顯增加切口部位組織的VEGF水平，從而促進(jìn)切口處血管的形成，促進(jìn)切口愈合，其具體作用的信號(hào)傳導(dǎo)通路需進(jìn)一步研究。

TNF-α是一種單核因子。目前研究表明，重組人腫瘤壞死因子α(recombinant human α-tumor necrosis factor，rh-TNF-α)的介入使傷口局部炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，提高了早期炎性反應(yīng)的水平，同時(shí)使抗感染能力提高，并且有助于一些細(xì)胞因子如表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、血小板源生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)等及其他炎性介質(zhì)的分泌表達(dá)，產(chǎn)生促進(jìn)傷口愈合作用［5］。本研究結(jié)果表明，rhG-CSF對(duì)手術(shù)合并化療的大白兔無(wú)提高外周血TNF-α水平的作用，考慮原因可能與化療后的骨髓抑制使單核細(xì)胞減少，從而分泌的TNF-α減少有關(guān)，這也是化療藥物抑制切口愈合的可能機(jī)制之一。

綜上所述，在手術(shù)加化療的同時(shí)使用rhG-CSF局部外用，對(duì)家兔具有促進(jìn)手術(shù)切口愈合作用，值得今后在臨床上進(jìn)一步研究。

［1］Sari A，Gurbuz O，Yilmaz N，et al.Granulocyte-colony stimulating factor improves the survival of ischaemic skin flaps by the induction of angiogenesis［J］.J Plast Reconstr Aesthet Surg，2009，62:1035-1041.

［2］Garlet GP，Horwat R，Ray HL Jr，et al.Expression analysis of wound healing genes in human periapical granulomas of progressive and stable nature［J］.J Endod，2012，38:185-190.

［3］ John Christoforidis，Robert Ricketts，Cedric Pratt，et al.The effect of intravitreal anti-VEGF agents on peripheral wound healing in a rabbit model［J］.Clin Ophthalmology，2012，6:61-69.

［4］ Matias MA，Saunus JM，Ivanovski S，et al.Accelerated wound healing phenotype in Interleukin 12/23 deficient mice［J］.J Inflamm，2011，20:39-49.

［5］吳洋，周樹(shù)夏，李秀娟，等.外源性rh-TNF-α局部介入對(duì)創(chuàng)傷愈合的影響［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22:1120-1122.