糞腸球菌產(chǎn)伏爾加霉素E5的生物學(xué)特性研究

張永紅，李煥榮，阮文科，鮑宇暉，陸 彥，崔德鳳，2＊

（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206；2.獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206）

很多微生物能夠產(chǎn)生各種具有抗菌活性的物質(zhì)。在這些抗菌物質(zhì)組成中包括由乳酸菌產(chǎn)生的一類物質(zhì)，稱之為細(xì)菌素（bacteriocins）。細(xì)菌素是某些細(xì)菌在代謝過程中由核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的具有抑菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物，細(xì)菌素分泌到細(xì)胞外發(fā)揮抑菌或殺菌作用，具有天然、高效、無殘留等優(yōu)點(diǎn)。產(chǎn)生細(xì)菌素的細(xì)菌來自復(fù)雜的細(xì)菌群落，如胃腸道菌群、口腔黏膜、生殖道黏膜或者其他的上皮細(xì)胞表面，提示細(xì)菌素產(chǎn)生菌具有細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)群體動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)作用。細(xì)菌素具有生物活性蛋白和殺菌作用，這一特性激發(fā)了人們從革蘭陽性和革蘭陰性細(xì)菌中篩選、分離、純化和應(yīng)用細(xì)菌素的興趣［1］，尤其是從益生性乳酸菌中尋找細(xì)菌素產(chǎn)生菌，因?yàn)樗鼈兇蠖鄶?shù)屬于食品級的微生物，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)并且細(xì)菌素又賦予了作為食品保藏的應(yīng)用前景。隨著研究的深入，細(xì)菌素正在作為抗菌劑在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用，預(yù)防某些傳染病的發(fā)生、發(fā)展［2］。

產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸菌包括乳酸桿菌屬、雙岐桿菌屬、糞腸球菌、屎腸球菌、乳酸乳球菌、乳酸片球菌、嗜熱鏈球菌和芽胞乳桿菌屬等。產(chǎn)生細(xì)菌素是腸球菌的一個(gè)重要生物學(xué)特性。多種腸球菌可以產(chǎn)生細(xì)菌素，糞腸球菌和屎腸球菌為主要的細(xì)菌素產(chǎn)生者，腸球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素稱之為伏爾加霉素（enterocin），具有多樣性特征，在一些菌株已檢測到enterocin A［3］、enterocin B［4］、enterocin P［5］及enterocin SE-K4［6］等，此類細(xì)菌素屬于小分子量、熱穩(wěn)定型Ⅱa類細(xì)菌素，已成為目前細(xì)菌素研究的熱點(diǎn)，這些細(xì)菌素產(chǎn)生菌大多來源于香腸、奶制品、橄欖等食物源腸球菌。du Toit M等［7］從實(shí)驗(yàn)用迷你豬糞便中分離到產(chǎn)細(xì)菌素腸球菌，屎腸球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素特性與enterocin A相近，抑菌譜較窄，僅能抑制同屬腸球菌、李斯特菌、梭狀芽胞桿菌和丙酸菌屬細(xì)菌，對革蘭陰性細(xì)菌無抑菌活性。

隨著抗生素耐藥性問題的日益嚴(yán)重，研究和開發(fā)新型抗菌藥物已迫在眉睫，細(xì)菌素在治療細(xì)菌性疾病方面顯示出巨大的潛力。如用乳酸菌的細(xì)菌素防治由幽門螺桿菌引起的胃潰瘍［8］，革蘭陽性菌引起的牛乳腺炎［9］及細(xì)菌素對雛雞感染雞白痢的保護(hù)作用［10］。因此，篩選和鑒定pH活性范圍廣，耐熱性強(qiáng)，抑菌譜廣的細(xì)菌素尤為重要。本研究從北京健康黑豬胃腸道分離到具有抑菌活性的益生性糞腸球菌，對其所產(chǎn)細(xì)菌素enterocin E5進(jìn)行pH活性范圍、耐熱性、對各種水解酶的敏感性以及畜禽常見病原菌抑菌活性的測定，為enterocin的進(jìn)一步應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 糞腸球菌E5由微生物實(shí)驗(yàn)室分離篩選，27株指示菌，包括6株大腸埃希菌，1株雞白痢沙門菌，4株雞傷寒沙門菌，1株腸炎沙門菌，1株肺炎克雷伯桿菌，1株變形桿菌，2株多殺性巴氏桿菌，1株單核細(xì)胞增生李斯特菌，1株馬腺疫鏈球菌，2株鏈球菌，2株金黃色葡萄球菌，2株炭疽芽胞桿菌，1株蠟樣芽胞桿菌，1株屎腸球菌和1株糞腸球菌，均由獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 PYG培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，腦心浸液培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基略。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌復(fù)壯 將在-20℃保存的腸球菌和指示菌分別接種在適宜培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，連傳2代并接種斜面培養(yǎng)基4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 腸球菌上清液制備 取培養(yǎng)18h的腸球菌培養(yǎng)液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，10 000r／min離心30min，取上清液備用。

1.2.3 pH對腸球菌細(xì)菌素的影響 腸球菌上清液分別用3mol／L的NaOH溶液或鹽酸溶液調(diào)pH至pH 2至pH 12于37℃水浴2h后，再調(diào)回對照pH 6.5，檢測抑菌活性。測定腸球菌上清液在不同pH條件下抑菌活性的變化，以上清液原液為對照。

1.2.4 蛋白酶對腸球菌細(xì)菌素的影響 評價(jià)腸球菌細(xì)菌素對各種蛋白酶的敏感性，取制備好的2mL腸球菌上清液，分別加入蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶終濃度分別為0.1、15g／L，于37℃水浴中溫育2h后，65℃加熱30min使殘余酶失活，加樣100μL／孔，加到已分別涂布3株指示菌的平板，37℃，24h培養(yǎng)后測定其抑菌圈直徑，以未加蛋白酶的腸球菌上清液為對照，檢測抑菌活性的變化。

1.2.5 耐熱性試驗(yàn) 取制備好的腸球菌上清液進(jìn)行以下熱處理：121℃壓、100℃ 、80℃和60℃水浴分別作用10min、20min，取100μL／孔，加到已分別涂布3株指示菌的平板，37℃，培養(yǎng)24h后測定腸球菌上清液抑菌活性，以未處理上清液作為對照，檢測抑菌活性的變化。

1.2.6 抑菌譜的測定 為了檢測腸球菌細(xì)菌素enterocin E5對畜禽病原菌的抑菌活性，采用以下指示菌做抑菌試驗(yàn)，包括動(dòng)物源重要病原菌革蘭陰性埃希菌屬、沙門菌屬、克雷伯菌屬菌、變形桿菌屬、多殺性巴氏桿菌，革蘭陽性的金黃色葡萄球菌、鏈球菌，革蘭陽性芽胞桿菌包括炭疽芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌，革蘭陽性無芽胞桿菌如單核細(xì)胞增生李斯特菌，以及腸球菌屬內(nèi)的益生菌如B1屎腸球菌和B2糞腸球菌。

抑菌試驗(yàn)驗(yàn)采用瓊脂擴(kuò)散法，在涂布指示菌的PYG平板上，用打孔器在平板上打孔，孔徑6mm、孔距2cm～3cm，用酒精燈加熱封底，中央孔內(nèi)，加入糞腸球菌E5上清液100μL，另設(shè)生理鹽水對照孔，每株指示菌3個(gè)重復(fù)，待細(xì)菌上清液4℃冰箱靜止擴(kuò)散完后，倒置37℃培養(yǎng)24h，測定其抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 腸球菌細(xì)菌素對酸堿的耐受性

enterocin E5去細(xì)胞上清液對酸堿處理的耐受性如圖1所示。enterocin E5經(jīng)3mol／L的鹽酸處理后對指示菌抑菌活性降低不顯著，經(jīng)3mol／L的NaOH處理后仍保留有較高活性。在pH 2～12處理后，對大腸埃希菌F41均有抑菌活性。在pH2和3時(shí)enterocin E5保持較高的抑菌活性；當(dāng)pH4～6時(shí)顯示出最強(qiáng)的抑菌活性；pH從中性7上升到堿性12時(shí)，抑菌活性逐漸減低，但pH為12時(shí)細(xì)菌上清液仍保留部分活性，這些說明enterocin E5對酸堿是比較穩(wěn)定的，具有很寬泛的pH耐受范圍。

圖1 enterocin E5對pH的耐受性Fig.1 pH tolerance of enterocin E5

2.2 腸球菌細(xì)菌素對蛋白酶的敏感性

由表1可見，經(jīng)5種水解酶以不同濃度處理后，淀粉酶、脂肪酶對抑菌活性沒有影響，蛋白酶組隨著酶濃度的升高，enterocin E5對K88，F(xiàn)41和金黃色葡萄球菌的抑菌效果均有不同程度的減弱，尤其酶濃度達(dá)到5g／L時(shí)，對3株指示菌抑菌活性的減弱作用極顯著（P＜0.01），說明腸球菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對蛋白酶敏感。

2.3 腸球菌細(xì)菌素對熱的耐受性

由表2可以看出，enterocin E5對熱具有一定的耐受性，60、80、100、121℃、處理10min和20min與對照組比較，對3株指示菌的抑菌活性幾乎沒有影響，僅121℃、處理20min組，抑菌活性略有下降，表明enterocin E5對熱具有一定的抵抗力，屬于耐熱型細(xì)菌素。

2.4 腸球菌細(xì)菌素enterocin E5抑菌譜

腸球菌細(xì)菌素enterocin E5顯示了廣譜的抗菌活性，對23株指示菌具有抑制作用（包括21株動(dòng)物源病原微生物和2株益生菌）。能夠廣泛抑制腸桿菌科的革蘭陰性病原菌，對7株豬源腸毒素型大腸埃希菌和1株雞源致病性大腸埃希菌抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到16mm～18.5mm，對雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌、變形桿菌和肺炎克雷伯也有較強(qiáng)的抑制作用，特別對產(chǎn)生廣譜抗藥性的雞傷寒沙門菌LY1、雞傷寒沙門菌LY2和腸炎沙門菌C4分離株具有明顯的抑菌活性；能夠抑制多殺性巴氏桿菌（分離自病死豬和雞）；抑制革蘭陽性金黃色葡萄球菌、馬腺疫鏈球菌、豬鏈球菌XY，對2株炭疽芽胞桿菌弱毒株和蠟樣芽胞桿菌產(chǎn)生顯著的抑菌活性；能夠抑制同屬的屎腸球菌、糞腸球菌；僅對4株菌沒有抑制作用（單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌ND、鏈球菌ND和雞傷寒沙門菌LY3）（表3）。

表1 Enterocin E5對酶的敏感性Table 1 Sensitivity of enterocin E5to enzymes

表2 Enterocin E5對熱的穩(wěn)定性Table 2 Heat stability of enterocin E5

表3 Enterocin E5對27株指示菌的抑菌作用Table 3 Inhibitory results of enterocin E5on 27indicator strains

續(xù)表3

3 討論

根據(jù)細(xì)菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用方式通常分為4類：第1類硫醚抗生素（lantibiotics），分子質(zhì)量?。? ku～5ku），尼生素（Nisin）屬于此類。第2類細(xì)菌素是小分子熱穩(wěn)定肽（small heat-stable peptide，SH SP），對熱不敏感，分子質(zhì)量3ku～6ku，又分為4個(gè)亞型，其中Ⅱa亞型細(xì)菌素是2類中研究最深入的，也是最大的一群。片球菌素（pediocin）屬于此群。第3類是大分子熱不穩(wěn)定肽（large heat-labile protein，LHLP），分子質(zhì)量大于10ku，對熱不穩(wěn)定，為蛋白類細(xì)菌素。第4類是復(fù)合細(xì)菌素，活性由脂類或碳水化合物組成的大分子復(fù)合物決定。

不同種類細(xì)菌素具有不同的pH活性范圍、溫度的穩(wěn)定性和對水解酶的敏感性。環(huán)境pH發(fā)生改變，則細(xì)菌素的溶解性、穩(wěn)定性和活性都隨之變化。分離自發(fā)酵香腸的植物乳桿菌LP 31蛋白水解酶處理后失活，能夠抵抗過氧化氫酶，最大活性pH范圍為5.0～6.0。蠟樣芽胞桿菌的細(xì)菌素80℃抑菌活性穩(wěn)定，當(dāng)溫度達(dá)到90℃時(shí)失活，能夠抵抗胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，對蛋白酶K和鏈酶蛋白酶E敏感，pH活性范圍6.0～9.0［11］。分離自戊糖片球菌Strain ST44AM產(chǎn)生的細(xì)菌素在pH 2.0～12處理2h，抑菌活性無變化，100℃經(jīng)120min或121℃經(jīng)20min處理仍然致敏感菌細(xì)胞溶解、酶和DNA裂解，蛋白水解酶處理失活，能夠耐受淀粉酶、聚乙二醇辛基苯基醚、SDS等作用［12］。而植物乳桿菌G所產(chǎn)細(xì)菌素的pH活性范圍為4.0～5.5。pH越低其抑菌活性越高，說明酸性條件下細(xì)菌素更容易發(fā)揮抑菌作用，此細(xì)菌素為酸依賴型細(xì)菌素［13］。

由于高溫可以使蛋白質(zhì)或多肽的高級構(gòu)象和空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)或多肽失活，而使得細(xì)菌素的抑菌活性降低。就對極端高溫的敏感性而言，小分子多肽比蛋白質(zhì)的抗性要強(qiáng)［14］。Helveticin J由瑞士乳酸桿菌481產(chǎn)生，分子質(zhì)量37ku，屬于大分子蛋白質(zhì)，該細(xì)菌素對蛋白酶和高溫處理敏感，100℃經(jīng)30min失活，證明了大分子細(xì)菌素的抗熱性較低，屬于不耐熱型細(xì)菌素［15］。本研究表明腸球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素enterocin E5在不同pH處理后抑菌作用影響不同，在pH2～12時(shí)，均保留有抑菌活性；在pH2和pH3時(shí)enterocin E5具有較高的活性；當(dāng)pH3～7時(shí)顯示最強(qiáng)的抑菌活性；pH由中性到堿性時(shí)，抑菌活性逐漸減弱，細(xì)菌素部分失活，但pH為12時(shí)仍保留部分活性，說明enterocin E5具有很寬泛的pH活性范圍。該細(xì)菌素能夠抵抗121℃高溫處理20min，對高濃度蛋白酶處理敏感，說明enterocin E5是一種熱穩(wěn)定性物質(zhì)，由此可以初步判斷細(xì)菌素enterocin E5為小分子蛋白多肽類物質(zhì)，屬于Ⅱa亞型［16］。

以前分離的乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素抑菌譜比較窄，主要對種內(nèi)細(xì)菌有抑制作用，很少對其他種屬的細(xì)菌有抑制作用。Nisin對大多數(shù)革蘭陽性菌起作用，如肉毒梭菌、乳桿菌、李斯特菌和金黃色葡萄球菌等，但對革蘭陰性菌、霉菌、酵母菌以及乳鏈菌肽產(chǎn)生菌無效。在一定條件下，Nisin與鰲合劑EDTA或檸檬酸鹽同時(shí)作用，可以改變指示菌細(xì)胞壁的滲透性，使一些革蘭陰性菌如大腸埃希菌和沙門菌對Nisin敏感［17］。近年來發(fā)現(xiàn)了對革蘭陽性、革蘭陰性均有抑制活性的細(xì)菌素［18-19］。

本文研究的enterocin E5細(xì)菌素抑菌譜較廣，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、抵抗力較強(qiáng)的芽胞桿菌均有抑菌活性。enterocin E5對21株動(dòng)物源病原微生物具有抑制作用。能夠廣泛抑制腸桿菌科的病原菌，對7株豬源腸毒素型大腸埃希菌和1株雞源致病性大腸埃希菌抑制作用最強(qiáng)，對雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌、變形桿菌和肺炎克雷伯也有較強(qiáng)的抑制作用，特別對產(chǎn)生多重抗藥性的3株雞傷寒沙門菌具有明顯的抑菌活性，能夠抑制多殺性巴氏桿菌（分離自病死豬和雞），抑制革蘭陽性金黃色葡萄球菌、馬腺疫鏈球菌、豬鏈球菌，對2株炭疽芽胞桿菌弱毒株和蠟樣芽胞桿菌產(chǎn)生顯著的抑菌活性。而分離自乳酪屎腸球菌產(chǎn)生的enterocin A顯示了非常窄譜的抗菌活性，僅能夠抑制同屬的腸球菌和李斯特菌［20］。

Ⅱa細(xì)菌素具有獨(dú)特的抗李斯特菌活性［21-22］，絕大多數(shù)能夠抑制李斯特菌的生長，而enterocin E5對李斯特菌無抑制作用，與多數(shù)腸球菌的特征不符［23］?？估钏固鼐钚詸z測通常作為不同來源腸球菌細(xì)菌素的評價(jià)方法［24-25］。也有報(bào)道證明暴露于高濃度細(xì)菌素后存活的指示菌獲得了對相同細(xì)菌素的抵抗力［26］。某些李斯特菌株可以表現(xiàn)出對細(xì)菌素的天然或者獲得耐受。Ennahar等比較了31株李斯特菌對4種Ⅱa細(xì)菌素enterocin A，mesentericin Y105，divercin V41和pediocin AcH的敏感性，結(jié)果顯示4種Ⅱa細(xì)菌素對李斯特菌從完全抑制到?jīng)]有活性作用相似，僅對1株李斯特菌沒有抑菌活性［20］。本研究中Enterocin E5對李斯特菌的抑菌作用，與大多數(shù)Ⅱa細(xì)菌素的抑菌活性不同，李斯特菌對enterocin E5的抗性原因有待進(jìn)一步研究。

本文首次報(bào)道產(chǎn)生enterocin E5細(xì)菌素的糞腸球菌分離自北京地方優(yōu)良品種——北京黑豬胃腸道，enterocin E5能夠廣泛抑制產(chǎn)腸毒素型大腸埃希菌和具有多重耐藥性的雞傷寒沙門菌，這一特性與北京黑豬強(qiáng)大抗病力的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。Ayeni等發(fā)現(xiàn)分離自奶制品的乳酸乳球菌、乳酸短桿菌對多重抗性尿道革蘭陰性病原菌具有抑制活性［27］，某些乳酸桿菌產(chǎn)生的廣譜抑菌物質(zhì)能夠抑制大腸埃希菌的生長［28］，還沒有腸球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素抑制多株腸毒素型大腸埃希菌和多重抗藥性雞傷寒沙門菌的報(bào)道。

enterocin E5廣譜的抗菌特性在已發(fā)現(xiàn)的伏爾加霉素中顯示了高效的抑菌作用，目前僅有少數(shù)乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素對抗革蘭陰性菌［29］。對動(dòng)物源病原微生物廣譜抑制作用的能力，以及寬泛的pH活性范圍和對高溫的耐受性，提示enterocin E5無論在腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)，還是抗菌藥物領(lǐng)域的研究和應(yīng)用上都很有潛力。特別對多重抗藥性雞傷寒沙門菌的抑菌作用，對家禽的飼養(yǎng)、疫病防控具有重要的意義。

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