關(guān)中奶山羊隱性乳房炎病原菌的分離鑒定

姚運(yùn)亮，田婷婷，許君艷，李 杰，李前瑞，陳德坤

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

陜西省關(guān)中地區(qū)是我國奶山羊的重點(diǎn)養(yǎng)殖地區(qū)［1］。奶山羊養(yǎng)殖過程中，乳房炎是影響奶山羊養(yǎng)殖效益的疾病之一，給奶山羊養(yǎng)殖造成較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也給羊奶產(chǎn)品帶來了潛在的食品質(zhì)量安全風(fēng)險［2］。奶山羊乳房炎可分為臨床乳房炎和隱性乳房炎，臨床乳房炎易于診斷，一旦發(fā)現(xiàn)可以采取有效措施進(jìn)行治療［3］。然而，隱性乳房炎患畜的乳房和乳汁外觀均無明顯變化，很難引起飼養(yǎng)管理人員的注意，往往不能及時采取有效的預(yù)防、診斷和治療措施，隨著病程的進(jìn)行則發(fā)展為臨床型乳房炎［4］。所以，及早診斷奶山羊隱性乳房炎，對奶山羊健康生產(chǎn)具有重大的意義。

為了解陜西省富平縣奶山羊隱性乳房炎的發(fā)病情況和引起隱性乳房炎的主要病原菌種類，為防治奶山羊隱性乳房炎提供依據(jù)。我們對陜西省富平縣的3個大型關(guān)中奶山羊養(yǎng)殖場和5個養(yǎng)殖集中村的關(guān)中奶山羊進(jìn)行了乳汁抽樣檢測和病原菌的分離與鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

普通瓊脂平板，綿羊血瓊脂平板，麥康凱瓊脂平板，含10mL／L血清的LB液體培養(yǎng)基，均按常規(guī)方法制備；奶山羊隱性乳房炎診斷液，實(shí)驗室制備；細(xì)菌生化微量鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 乳房炎檢測及乳樣采集 本研究于2011年6月至10月對陜西富平縣的奶山羊主要養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖集中村進(jìn)行了隱性乳房炎隨機(jī)抽樣檢測和隱性乳房炎陽性樣品的采集。乳房炎檢測前，首先用濕毛巾將泌乳羊乳房擦洗干凈，棄去前兩把奶，然后取2mL羊奶加入等量的奶山羊隱性乳房炎診斷液，反復(fù)搖勻，觀察并記錄診斷結(jié)果。對檢測陽性的乳區(qū)，先用溫水清洗乳房，再用1g／L的新潔爾滅消毒乳頭，最后用高壓滅菌過的紙巾將乳頭擦干，再次棄掉前兩把奶，然后采集此隱性乳房炎陽性的乳汁5mL～10mL于滅菌的離心管中，標(biāo)記樣品。

1.2.2 病原菌的分離 搖勻乳樣后，取40μL涂布接種于血平板上，37℃溫箱培養(yǎng)24h～48h后，觀察菌落形態(tài)特征，挑取單個菌落接種于含有10mL／L血清的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫空氣浴搖床振培過夜。

1.2.3 病原菌的鑒定 將增菌后菌液接種于普通瓊脂平板、綿羊血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)24h～48h。觀察平板細(xì)菌生長情況，根據(jù)菌落的形態(tài)特點(diǎn)，挑取典型菌落涂片，革蘭染色，鏡檢。

1.2.4 球菌的鑒定 將所有的球菌做觸酶試驗，取觸酶試驗陽性的菌株做凝固酶試驗、葡萄糖發(fā)酵試驗和甘露醇發(fā)酵試驗；取觸酶試驗陰性的菌株做各種醇、糖、苷類的發(fā)酵試驗［5］。

1.2.5 桿菌的鑒定 將所有的桿菌做IMViC試驗、麥芽糖的發(fā)酵試驗。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株的培養(yǎng)觀察結(jié)果

分離菌株的菌落主要有如下3個特點(diǎn)：①類菌株在普通瓊脂平板上形成濕潤、光滑、隆起、黃色或乳白色、中等大小的圓形菌落，在綿羊血瓊脂平板形成濕潤、光滑、隆起的較大的菌落，并能呈明顯的β溶血；②類菌株在普通瓊脂平板上不生長，在綿羊血瓊脂平板上形成淡灰色、隆起、閃光、黏稠的小菌落并能產(chǎn)生α或β溶血；③類菌株在普通瓊脂平板上形成圓形凸起、光滑、濕潤、半透明、灰白色的大菌落，在綿羊血瓊脂平板上部分菌株有溶血現(xiàn)象，在麥康凱瓊脂平板上形成紅色菌落。

2.2 染色鏡檢結(jié)果

革蘭染色后顯微鏡下觀察結(jié)果：①類細(xì)菌呈革蘭陽性，圓形，排列成葡萄串狀；②類細(xì)菌呈革蘭陽性，圓形或卵圓形，排列成鏈狀或成雙存在；③類細(xì)菌呈革蘭陰性，桿狀，兩端鈍圓，散在或成對存在。

2.3 生化反應(yīng)結(jié)果

根據(jù)以上細(xì)菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征，初步判定：①為葡萄球菌，②為鏈球菌，③為大腸埃希菌。此3種菌的生化特性結(jié)果見表1、表2、表3。

表1 葡萄球菌的生化特性鑒定結(jié)果Table 1 Biochemical characterization of Staphylococcus

表2 鏈球菌的生化特性鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical characterization of Streptococcus

表3 大腸埃希菌的特性鑒定結(jié)果Table 3 Biochemical characterization of Escherichia coli

2.4 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

對364份隱性乳房炎陽性樣品中所分離出的337株病原菌進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定得出如下結(jié)果：凝固酶陰性葡萄球菌186株，金黃色葡萄球菌50株，大腸埃希菌61株，乳房鏈球菌24株，豬鏈球菌9株，蠟樣芽胞桿菌5株，克雷伯菌1株，巴氏桿菌1株，各種細(xì)菌所占比例見圖1。

3 討論

圖1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果Fig.1 The results of Bacteria Separated and Identified

凝固酶陰性葡萄球菌以前很少被認(rèn)為是乳房炎病原菌［6］，但SupréK 等［7］報道顯示，引起奶山羊隱性乳房炎的病原菌中，凝固酶陰性的葡萄球菌占25%～93%，金黃色葡萄球菌占3%～37%，在凝固酶陰性的葡萄球菌中，最主要的是表皮葡萄球菌，木糖葡萄球菌，產(chǎn)色葡萄球菌，模仿葡萄球菌和山羊葡萄球菌。分析認(rèn)為，凝固酶陰性的葡萄球菌是動物體表和環(huán)境中的常在菌，這類細(xì)菌很容易通過擠奶工人的手或未徹底消毒的擠奶機(jī)而在擠奶的過程中感染動物的乳腺，引起乳腺炎的發(fā)生［8-9］。本研究結(jié)果顯示，凝固酶陰性的葡萄球菌是引起奶山羊隱性乳房炎的主要病原菌，占到所分離病原菌總量的55%。

乳房鏈球菌、無乳鏈球菌和豬鏈球菌同樣也是乳房炎病原菌［10］。本研究中分離到的鏈球菌經(jīng)生化鑒定結(jié)果顯示只有乳房鏈球菌和豬鏈球菌兩種。豬鏈球菌雖然也能夠引起奶山羊乳房炎的發(fā)生，但根據(jù)Pisoni G等［11］的報道，它并不是引起奶牛和奶山羊乳房炎的主要致病菌。本研究之所以分離到了較多的豬鏈球菌，我們推測，這可能與奶山羊養(yǎng)殖戶不重視管理，將奶山羊與其他動物混養(yǎng)在一起，造成動物之間的交叉感染有關(guān)。鏈球菌一直都被認(rèn)為是引起動物急性、慢性乳房炎的病原菌之一［12］。其感染乳腺以后不產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)，機(jī)體很難自動清除此類病原菌，目前也沒有可靠的多價菌苗進(jìn)行預(yù)防［13］。因此，對于鏈球菌引起的乳房炎的預(yù)防還需要從改善養(yǎng)殖環(huán)境入手。

另外，本試驗還分離出了5株蠟樣芽胞桿菌、1株巴氏桿菌和1株克雷伯菌。蠟樣芽胞桿菌感染機(jī)體引起乳腺炎的報道在20世紀(jì)七八十年代有所報道［14-15］，但近年來沒見到類似報道。因此，本試驗中所分到的蠟樣芽胞桿菌，并不能確定一定是乳腺內(nèi)的致病菌，也有可能是土壤中的芽胞污染乳樣所致。巴氏桿菌和克雷伯菌都可以引起乳腺炎，但都不是主要的致病菌，無論是在奶山羊還是奶牛乳腺炎致病菌中的檢出率都很低［16］。

國內(nèi)外研究顯示，有效的疫苗預(yù)防能夠顯著降低乳房炎的發(fā)生率［17-18］。目前，對于乳房炎疫苗的研究大多致力于金黃色葡萄球菌疫苗和大腸埃希菌疫苗的研究，然而本研究表明，凝固酶陰性葡萄球菌也是主要的病原菌。因此，本研究結(jié)果對于開發(fā)適合關(guān)中奶山羊隱性乳房炎的疫苗有著重要的指導(dǎo)意義。

［1］ 祁艷霞，陳玉林，劉洪瑜，等.關(guān)中奶山羊基本情況調(diào)查［J］.中國草食動物，2005，25（4）：32-33.

［2］ Koop G，van Werven T，Schuiling H J，et al.The effect of subclinical mastitis on milk yield in dairy goats［J］.J Dairy Sci，2010，93（12）：5809-5817.

［3］ Moroni P，Vellere F，Antonini M，et al.Antibiotic susceptibility of coagulase-negative staphylococci isolated from goats’milk［J］.Inter J Antimicr Agents，2004，23（6）：637-640.

［4］ McDougall S，SupréK，De Vliegher S，et al.Diagnosis and treatment of subclinical mastitis in early lactation in dairy goats［J］.J Dairy Sci，2010，93（10）：4710-4721.

［5］ 路建彪，劉文強(qiáng).奶牛乳房炎病原菌的分離與鑒定［J］.中國獸醫(yī)雜志，2007，43（1）：62-63.

［6］ Devriese L A，Dekeyser H.Prevalence of different species of coagulase-negative staphylococci on teats and in milk samples from dairy cows［J］.J Dairy Res，1980（47）：155-158.

［7］ SupréK，Haesebrouck F，Zadoks R N，et al.Some coagulasenegative Staphylococcus species affect udder health more than others［J］.J Dairy Sci，2011（94）：2329-2340.

［8］ Piessens V，De Vliegher S，Verbist B，et al.Intra-species diversity and epidemiology varies among coagulase-negative Staphylococcus species causing bovine intramammary infections［J］.Vet Microbiol，2012（1）：62-71.

［9］ Pyorala S，Taponen S.Coagulase-negative Staphylococci——Emerging mastitis pathogens［J］.Vet Microbiol，2009（134）：3-8.

［10］ Bergonier D，De Cremoux R，Rupp R，et al.Mastitis of dairy small ruminants［J］.Vet Res Communicat，2003（34）：689-716.

［11］ Pisoni G，Zadoks R N，Vimercati C，et al.Epidemiological investigation of Streptococcus equi subspecies zooepidemicus involved in clinical mastitis in dairy goats［J］.J Dairy Sci，2009（3）：943-951.

［12］ Guélat-Brechbuehl M，Thomann A，Albini S，et al.Crosssectional study of Streptococcus species in quarter milk samples of dairy cows in the canton of Bern，Switzerland［J］.Vet Rec，2010（6）：211-215.

［13］ 粱瑞琴，劉 強(qiáng).奶牛乳房炎鏈球菌的分離與鑒定［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2009，30（2）：64-65.

［14］ Schiefer B，Macdonald K R，Klavano G G，et al.Pathology of Bacillus cereus mastitis in dairy cows［J］.Canadian Vet J Rev Vet Canadienne，1976（17）：239-243.

［15］ Perrin D，Greenfield J，Ward G E.Acute Bacillus cereus mastitis in dairy cattle associated with use of a contaminated antibiotic associated with use of a contaminated antibiotic［J］.Can Vet J Rev，1976（17）：244-247.

［16］ Malinowski E，Lassa H，Klossowska A，et al.Etiological agents of dairy cows＇mastitis in western part of Poland［J］.Polish J Vet Sci，2006（9）：191-194.

［17］ Calzolari A，Giraudo J A，Rampone H，et al.Field trials of a vaccine against bovine mastitis.2.Evaluation in two commercial dairy herds［J］.J Dairy Sci，1997，80（5）：854-858.

［18］ Leitner G，Krifucks O，Kiran M D，et al.Vaccine development for the prevention of staphylococcal mastitis in dairy cows［J］.Vet Immunol Immunopathol，2011，142（1-2）：25-35.