兩面針?biāo)嵛飳?duì)酵母朊病毒作用研究

鐘正偉

（承德石油高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)工程系，河北承德067000）

迄今為止對(duì)朊病毒引起的哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如瘋牛病、羊癢病、人庫(kù)魯病和克－雅氏癥等仍缺乏有效的治療辦法和治療藥物，利用構(gòu)建的動(dòng)物模型、動(dòng)物細(xì)胞模型、無(wú)細(xì)胞模型和酵母模型進(jìn)行抗朊病毒藥物的篩選目前是國(guó)際生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［1－5］。借助酵母朊病毒［PSI＋］易于檢測(cè)的遺傳表型（紅色為正常型，白色為致病型）及其與哺乳動(dòng)物具有嚴(yán)格種間屏障的優(yōu)勢(shì)，Bach等建立了一種安全、高效的基于酵母朊病毒［PSI＋］的抗朊病毒藥物篩選模型，該模型首先利用酵母朊病毒［PSI＋］的表型初篩抗朊病毒候選藥物，然后采用SDS－PAGE／Western blot技術(shù)通過(guò)分析藥物作用后酵母朊病毒聚集狀態(tài)來(lái)檢測(cè)候選藥物的抗朊病毒效果；利用該模型Bach等從近4 000種小分子化合物中篩選發(fā)現(xiàn)了菲啶（phenanthridine）、6－氨基菲啶（6－aminophenanthridine）、胍那芐（guanabenz）等11種化合物可以使酵母朊病毒［PSI＋］的白色表型治愈為紅色表型，同時(shí)其淀粉樣蛋白聚集狀態(tài)可以轉(zhuǎn)換為可溶單體狀態(tài)［6－8］。

盡管目前研究發(fā)現(xiàn)了戊聚糖多硫酸酯、四磺酸基酞菁、兩性霉素B、奎納克林、菲啶和朊病毒抗體ICSM18等一系列代表性抗朊病毒候選藥物，但遺憾的是這些候選藥物在動(dòng)物試驗(yàn)中的效果并不理想［2－5］。近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道了某些中藥對(duì)與朊病毒疾病具有相似致病機(jī)制的阿爾茨海默病具有一定療效［9－10］，這暗示了從中藥領(lǐng)域?qū)ふ铱闺貌《舅幬锏目赡苄?。本文借助酵母朊病毒［PSI＋］表型并結(jié)合蛋白水平檢測(cè)朊病毒聚集體大小的半變性瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)（semi－denaturing detergent－agarose gel electrophoresis，SDD－AGE），研究發(fā)現(xiàn)了兩面針?biāo)嵛锞哂忻黠@的治愈酵母朊病毒［PSI＋］效果，這一方面為傳統(tǒng)中藥兩面針作為抗朊病毒候選藥物提供了試驗(yàn)依據(jù)，另一方面也將推動(dòng)抗朊病毒中藥制劑的篩選研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae：MATα kar1 SUQ5 ade2－1 his3Δ202 leu2Δ1 trp1Δ63 ura3－52 erg6：：KanMX，［PSI＋］，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院（NIH）的Masison D博士惠贈(zèng)；將［PSI＋］細(xì)胞劃線于含有5mmol／L鹽酸胍的1／2YPD固體平板上培養(yǎng)7d后，分離紅色單菌落得到［PSI＋］細(xì)胞。

1.1.2 培養(yǎng)基 1／2YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉5g／L，蛋白胨20g／L，葡萄糖20g／L，固體平板加入20 g／L瓊脂。

1.1.3 試劑和藥品 兩面針根購(gòu)自安徽亳州市真源堂藥業(yè)有限公司；酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉均購(gòu)自上海奧博星生物科技有限公司；鹽酸胍（guanidine hydrochloride，GuHCl）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗Sup35抗體與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)于上海西寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 兩面針?biāo)嵛锏闹苽?制備兩面針?biāo)嵛锇磪⒄瘴墨I(xiàn)［11］方法并做適當(dāng)調(diào)整，將兩面針根粉碎后80℃烘干，稱取粉末適量置于燒杯中，加相當(dāng)于中藥量20倍的純水浸泡2h后，煮沸30min，抽濾。藥渣加5倍水，煮沸20min，抽濾。合并濾液并于5 000r／min離心5min，去除沉淀后減壓濃縮成相當(dāng)于原藥1g／mL的藥液，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 兩面針?biāo)嵛飳?duì)酵母生長(zhǎng)的抑制作用分析采用二倍稀釋法結(jié)合血球計(jì)數(shù)法分析兩面針?biāo)嵛飳?duì)酵母生長(zhǎng)的影響［12］。取試管數(shù)支，以1／2YPD液體培養(yǎng)基對(duì)兩面針?biāo)嵛镞M(jìn)行對(duì)倍稀釋，濃度分別為500mg／mL～62.5mg／mL，然后在每管中按10%接種量接種活化培養(yǎng)的OD 600nm為0.5的酵母菌懸液，生長(zhǎng)對(duì)照為不加藥的1／2YPD液體培養(yǎng)體系。上述各接種物體系置24℃下培養(yǎng)24h，其間每間隔4h采用血球計(jì)數(shù)法監(jiān)測(cè)培養(yǎng)體系中酵母總菌落的變化。

1.2.3 兩面針?biāo)嵛飳?duì)酵母朊病毒［PSI＋］表型治療作用分析 按參照文獻(xiàn)方法并做適當(dāng)調(diào)整［6］，［PSI＋］酵母細(xì)胞在30℃過(guò)夜活化培養(yǎng)后，調(diào)整菌液OD 600nm為0.2左右，按10%接種量分別接種到含有指定濃度兩面針?biāo)嵛锏?／2YPD液體培養(yǎng)體系，所有體系于24℃震蕩培養(yǎng)5d，在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)間隔24h更換培養(yǎng)基和藥物。每天取培養(yǎng)液稀釋后涂布于1／2YPD固體平板，平板于24℃培養(yǎng)7d，觀察菌落顏色變化，照相并統(tǒng)計(jì)不同表型菌落的比例。

1.2.4 SDD－AGE／Western blot技術(shù)分析兩面針?biāo)嵛飳?duì)酵母朊病毒［PSI＋］的治療效果 SDDAGE／Western blot試驗(yàn)流程按參考文獻(xiàn)［13］進(jìn)行，將兩面針?biāo)嵛镒饔媒湍讣?xì)胞5d后涂布培養(yǎng)的1／2YPD固體平板上出現(xiàn)的不同顏色菌落活化后接種到1／2YPD液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)約12h，到菌液OD 600nm＝1.5左右時(shí)停止培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，然后加入裂解緩沖液，用珠磨儀裂解細(xì)胞，離心收集上清得到蛋白樣品；進(jìn)行15g／L的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后用在0℃、100V條件下轉(zhuǎn)膜1h，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，兔抗Sup35抗體（1∶2 000）孵育1h，4℃過(guò)夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000）孵育1h，采用ECL發(fā)光試劑盒對(duì)其進(jìn)行放射自顯影檢測(cè)，獲得圖像信息。

2 結(jié)果

2.1 兩面針?biāo)嵛飳?duì)酵母生長(zhǎng)的影響

研究表明，抗朊病毒化合物鹽酸胍治療酵母朊病毒［PSI＋］依賴于細(xì)胞分裂［14］，而且分析候選藥物對(duì)酵母朊病毒［PSI＋］的治療作用采用24℃液體培養(yǎng)，并間隔24h更換培養(yǎng)液的試驗(yàn)方法要求酵母細(xì)胞具有較快生長(zhǎng)速度［6］，為此首先分析了24℃培養(yǎng)條件下不同濃度兩面針?biāo)嵛飳?duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。如圖1所示，不加藥情況下，酵母生長(zhǎng)繁殖正常，菌落數(shù)量有規(guī)律地增加；兩面針?biāo)嵛餄舛葹?2.5mg／mL、125mg／mL時(shí)，對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響不大，菌落數(shù)量增長(zhǎng)規(guī)律與未加藥的基本接近；兩面針?biāo)嵛餄舛葹?50mg／mL、500mg／mL時(shí)，酵母細(xì)胞總數(shù)基本維持在接種時(shí)的水平，僅在小范圍內(nèi)波動(dòng)，這表明兩面針?biāo)嵛餄舛雀哂?50mg／mL時(shí)抑制酵母生長(zhǎng)。

圖1 兩面針?biāo)嵛飳?duì)酵母生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of aqueous extract fromZanthoxylum nitidum on cell growth of yeast prion

2.2 兩面針?biāo)嵛飳?duì)酵母朊病毒［PSI＋］表型的影響

酵母朊病毒［PSI＋］是酵母翻譯終止因子Sup35p的淀粉樣聚集形式，在［PSI＋］細(xì)胞中，Sup35p主要以聚集體形式存在導(dǎo)致無(wú)義突變抑制，產(chǎn)生終止密碼子通讀現(xiàn)象，使ade2－1突變的［PSI＋］細(xì)胞在腺嘌呤缺乏的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為白色菌落；在被治愈的［PSI－］細(xì)胞中，其Sup35p主要以可溶形式存在，非無(wú)義抑制的ade2－1突變株需要在含有腺嘌呤的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，細(xì)胞由于累積腺嘌呤合成途徑中的紅色中間產(chǎn)物而形成紅色菌落，這個(gè)表型系統(tǒng)可用來(lái)初步分析藥物對(duì)［PSI＋］表型的治療效果［6，15］。依據(jù)結(jié)果2.1，研究25、50、75、100、125mg／mL兩面針?biāo)嵛飳?duì)酵母朊病毒［PSI＋］表型的治療作用，如圖2所示，陽(yáng)性對(duì)照5mmol／L鹽酸胍作用白色［PSI＋］細(xì)胞后產(chǎn)生的紅色菌落隨著作用時(shí)間增加而增多；作用5d后紅色菌落比例為94.8%；兩面針?biāo)嵛餄舛葹?5mg／mL時(shí)作用［PSI＋］細(xì)胞不產(chǎn)生紅色菌落，與不加藥陰性對(duì)照的結(jié)果相同；當(dāng)兩面針?biāo)嵛餄舛雀哂?5mg／mL時(shí)，作用［PSI＋］細(xì)胞后產(chǎn)生的紅色菌落比列與藥物作用時(shí)間、藥物劑量均呈現(xiàn)較好的正相關(guān)性，并且125 mg／mL的兩面針?biāo)嵛镒饔茫跴SI＋］細(xì)胞5d后紅色菌落比例為90.2%，僅略低于陽(yáng)性對(duì)照的作用效果，這表明兩面針?biāo)嵛飳?duì)酵母朊病毒［PSI＋］表型具有明顯的治療作用。

圖2 酵母朊病毒［PSI＋］在兩面針?biāo)嵛镒饔貌煌瑫r(shí)間后的表型變化Fig.2 Phenotype changes of［PSI＋］cells after treatment with ZA in different time

2.3 蛋白水平分析兩面針?biāo)嵛飳?duì)酵母朊病毒［PSI＋］的治療作用

Bach S等［6］在蛋白水平分析候選藥物對(duì)酵母朊病毒［PSI＋］的治療效果時(shí)采用的傳統(tǒng)SDSPAGE／Western blot技術(shù)僅能分析朊病毒能否發(fā)生聚集，而近年來(lái)發(fā)展的半變性瓊脂糖凝膠電泳（SDD－AGE）結(jié)合 Western blot技術(shù)能夠精確檢測(cè)朊病 毒 聚 集 體 大 ?。?3，16－17］，因 此 引 入 SDD－AGE／Western blot技術(shù)分析兩面針?biāo)嵛镒饔媒湍鸽貌《荆跴SI＋］細(xì)胞后的朊病毒聚集體大小。如圖3所示，對(duì)照的［PSI＋］細(xì)胞朊病毒Sup35p主要以大分子聚集體形式存在，而［PSI－］細(xì)胞朊病毒Sup35p主要以可溶的小分子單體形式存在，兩面針?biāo)嵛镒饔?［PSI＋］細(xì)胞5d后白色菌落的朊病毒Sup35p聚集體大小與［PSI＋］細(xì)胞相似，說(shuō)明這些菌落沒(méi)有被治愈；兩面針?biāo)嵛镒饔茫跴SI＋］細(xì)胞5d后紅色菌落的朊病毒Sup35p主要以單體形式存在，與［PSI－］細(xì)胞的朊病毒Sup35p大小相當(dāng)，說(shuō)明這些菌落為兩面針?biāo)嵛镏斡模跴SI－］細(xì)胞。

圖3 SDD－AGE／Western blot分析兩面針?biāo)嵛飳?duì)酵母朊病毒［PSI＋］的作用Fig.3 Analysis of effects of ZA on yeast prion［PSI＋］cells with SDD－AGE／Western blot

3 討論

本文借助酵母朊病毒［PSI＋］表型和蛋白水平的SDD－AGE／Western blot技術(shù)分析了兩面針?biāo)嵛锏目闺貌《咀饔?；研究結(jié)果表明兩面針?biāo)嵛飳?duì)酵母朊病毒［PSI＋］具有明顯的治療效果。前期研究表明菲啶和某些菲啶衍生物能夠治愈酵母朊病毒［6］，另外兩面針提取物中的苯并菲啶類生物堿成分如氧化兩面針堿、二氫白屈菜紅堿、去－N－甲基白屈菜紅堿等與菲啶具有相同的母體結(jié)構(gòu)［6，18］，推測(cè)兩面針?biāo)嵛锬軌蛑斡湍鸽貌《荆跴SI＋］可能與其生物堿成分有關(guān)，但這仍需要更多的研究來(lái)證實(shí)。重要的是，本文研究報(bào)道了傳統(tǒng)中藥兩面針?biāo)嵛锞哂兄委熃湍鸽貌《净钚?，一方面為兩面針作為抗朊病毒候選藥物提供了試驗(yàn)依據(jù)，另一方面也將促進(jìn)從中藥領(lǐng)域?qū)ふ译貌《炯膊≈委熕幬锏难芯俊?/p>

［1］ Ghaemmaghami S，May B C，Renslo A R，et al.Discovery of 2－aminothiazoles as potent antiprion compounds［J］.J Virol，2010，84（7）：3408－3412.

［2］ Sim V L，Caughey B.Recent advances in prion chemotherapeutics［J］.Infect Disord Drug Targets，2009，9（1）：81－91.

［3］ Trevitt C R，Collinge J.A systematic review of prion therapeutics in experimental models［J］.Brain，2006，129 （9）：2241－2265.

［4］ 宋有濤，吳憲遠(yuǎn)，何星蓉.抗朊病毒藥物篩選模型的研究進(jìn)展［J］.遼寧大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，37（4）：289－293.

［5］ 鐘正偉，宋有濤.朊病毒治療候選藥物的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2011，27（9）：828－835.

［6］ Bach S，Talarek N，Andrieu T，et al.Isolation of drugs active against mammalian prions using ayeast－based screening assay［J］.Nat Biotechnol，2003，21（9）：1075－1081.

［7］ Bach S，Tribouillard D，Talarek N，et al.A yeast－based assay to isolate drugs active against mammalian prions［J］.Methods，2006，39（1）：72－77.

［8］ Tribouillard－Tanvier D，Béringue V，Desban N，et al.Antihypertensive drug guanabenz is activein vivoagainst both yeast and mammalian prions［J］.PLoS One，2008，3（4）：e1981.

［9］ 何金生，張 瑩，洪 濤.靶向PrP及Aβ的治療性抗體研究進(jìn)展［J］.中國(guó)科學(xué)，2010，40（8）：679－684.

［10］ 趙敬堃，王德生.中藥與中藥有效成分治療阿爾茨海默病的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，28（1）：177－182.

［11］ 李文哲，蘆 潔，孫曉宇，等.幾種中藥提取物和藥物對(duì)乙醇脫氫酶活性影響的研究［J］.中藥材，2006，29（8）：816－818.

［12］ 梁建芬，李 勇.抗菌素natamycin對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，9（1）：96－99.

［13］ 鐘正偉，王莉潔，謝 輝，等.定量研究菲啶對(duì)酵母朊病毒［PSI＋］的治愈作用［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2012，28（6）：737－746.

［14］ Byrne L J，Cox B S，Cole D J，et al.Cell division is essential for elimination of the yeast ［PSI＋］prion by guanidine hydrochloride［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（28）：11688－11693.

［15］ Song Y T，Wu Y X，Jung G M，et al.Role for Hsp70chaperone in Saccharomyces cerevisiae prion seed replication［J］.Eukaryot Cell，2005，4（2）：289－297.

［16］ Halfmann R，Lindquist S L.Screening for amyloid aggregation by semi－denaturing detergent－agarose gel electrophoresis［J］.J Vis Exp，2008，17（1）：1－4.

［17］ Song Y，Lan W J，Wu X Y，et al.Quantitative effects of magnesium chloride stress on aggregation of Sup35p in［PSI－］yeast cells［J］.Protein Pept Lett，2010，17（12）：1489－1494.

［18］ 李定祥，閔知大.兩面針中生物堿的分離［J］.中國(guó)天然藥物，2004，2（5）：285－288.