Visfatin基因過表達(dá)對(duì)PCOS模型大鼠血漿膽固醇代謝和肝膽固醇合成的影響

賀小紅，彭珊珊，任利容

深圳市寶安區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科(廣東深圳518133)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期婦女最常見的生殖內(nèi)分泌紊亂性疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，胰島素抵抗、肥胖及生殖內(nèi)分泌失調(diào)是其主要臨床特征，內(nèi)脂素(Visfatin)是新進(jìn)研究報(bào)道的脂肪細(xì)胞因子［1］，因其具有類胰島素樣作用在糖脂代謝紊亂所致疾病如糖尿病、高脂血癥等領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注，為代謝性疾病的病因研究和治療提供了新方向，但Visfatin在PCOS脂代謝方面的研究鮮有報(bào)道。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP－2)與羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG－CoA還原酶)是主要的膽固醇生物合成通路的調(diào)控元件，與膽固醇代謝密切相關(guān)。因此，本文擬通過構(gòu)建大鼠visfatin基因模型，通過重組真核表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入PCOS大鼠，觀察visfatin過表達(dá)對(duì)PCOS大鼠肝SREBP－2與HMG－CoA還原酶表達(dá)的影響，從而分析其對(duì)脂代謝的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模 40只SD清潔雌性大鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，以顆粒飼料喂養(yǎng)42d后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各20只。實(shí)驗(yàn)組行頸部皮下注射脫氫表雄酮(DHEA)0.3 mg/kg·d+0.2ml油劑+腹部皮下注射胰島素諾和靈0.2 IU/d，對(duì)照組在同期皮下注射0.2ml/d注射用油劑，兩組均連續(xù)注射28 d后取大鼠陰道粘液行連續(xù)陰道涂片檢查，出現(xiàn)陰道上皮失去周期性變化提示建模成功，造模成功后試驗(yàn)動(dòng)物分組:正常大鼠空質(zhì)粒注射組(NE組，n=10)、正常大鼠visfatin重組真核表達(dá)質(zhì)粒注射組(NT組，n=10)、PCOS大鼠空質(zhì)粒注射組(PE組，n=10)、PCOS大鼠visfatin重組真核表達(dá)質(zhì)粒注射組(PT組，n=10)。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測(cè)材料 pCDNA3.1(－)Vector(BD 公司產(chǎn)品)。重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，取SD大鼠新鮮內(nèi)臟脂肪組織提取總RNA，以此RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)大鼠內(nèi)脂素基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物。上游引物:5'－GCGAAT2TCGC CACCATGAATGCTGCGGCAGAAGC－3';下游引物:5'－GCCTCGAGCTAGTGAGGCGCCACATCCT－3'，分別在上、下游引物5'末端引入限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ識(shí)別序列，PCR擴(kuò)增。將雙酶切的PCR 產(chǎn)物、pcDNA3.1(+)質(zhì)粒純化，連接、轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆分別經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序鑒定。用去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒大量提取備用。

1.2.2 標(biāo)本采集 用空載及表達(dá)質(zhì)粒注射于大鼠股四頭肌，1 mg/kg，于注射前后72 h各取其空腹血(禁食12h，取尾靜脈血)，離心分離血漿，－80℃冰箱保存待測(cè)。于第2次取血后處死大鼠取肝臟組織和其他組織留存。

1.2.3 HMG－CoA 還原酶和 SREBP－2表達(dá)測(cè)定用常規(guī)方法提取大鼠肝組織總RNA，用RT－PCR測(cè)定肝HMG－CoA還原酶和SREBP－2 mRNA，以 βactin為內(nèi)參。HMG－CoA還原酶上游引物為:5'－CCTGCGTGTCCCTGGTCCTA－3';下游引物:5'－CTTTGGGTTACTGGGTTTGG－3'。SREBP－2上游引物:5'－GGCTCTGGCCGCAATGTA－3';下游引物:5'－TGACCGAGGAGCGTGAGT－3'。β－actin 上游引物:5'－CCACTGCC GCATCCTCTTCCTC2－3';下游引物:5'－TCCTGCTTGCTGATCCACATCT－3'。

1.2.4 采用ELISA測(cè)定血漿visfatin水平(大鼠visfatin ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)ADL公司)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 血漿Visfatin水平變化 各組血漿Visfatin水平較正常(NE)組顯著升高(P＜0.01)，見表 1。

表1 visfatin質(zhì)粒處理前后血漿Visfatin水平變化(n=10，±s)

表1 visfatin質(zhì)粒處理前后血漿Visfatin水平變化(n=10，±s)

注:與 NE 組比較#P＜0.01

F P Visfatin(ng/mL) 79.02±16.04 103.10±21.17* 104.80±26.03* 126.28±31.16*Group NE NT PE PT 6.343 ＜0.01

2.2 HMG－CoA 還原酶和 SREBP－2 mRNA 變化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PT組大鼠HMG－CoA還原酶mRNA及SREBP2 mRNA的表達(dá)較轉(zhuǎn)染前均升高(P＜0.05)，NT組HMG－CoA還原酶mRNA的表達(dá)較轉(zhuǎn)染前升高(P＜0.05)，但 NT組 SREBP2 mRNA 的表達(dá)較轉(zhuǎn)染前無明顯變化，見表2。

3 討論

內(nèi)脂素主要在內(nèi)臟脂肪組織中高表達(dá)，其組織表達(dá)量和血漿濃度的高低與內(nèi)臟肥胖程度呈正相關(guān)［2］。在代謝紊亂性疾病中對(duì)內(nèi)脂素的研究越來越多，廖鑫［3］等實(shí)驗(yàn)顯示visfatin水平分別與空腹血糖及HOMA－IR呈顯著正相關(guān)，與胰島素敏感指數(shù)成顯著負(fù)相關(guān)，說明糖尿病大鼠血清visfatin與血糖和胰島素抵抗密切相關(guān)，隨著血糖和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的進(jìn)一步增加而逐漸增高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糖尿病大鼠內(nèi)臟脂肪visfatinmRNA及血清visfatin水平較空白組顯著增高，內(nèi)臟脂肪組織visfatin表達(dá)與血清visfatin水平相一致，說明內(nèi)臟脂肪組織是visfatin表達(dá)的重要場(chǎng)所。PCOS是育齡期婦女最常見的生殖內(nèi)分泌紊亂性疾病，胰島素抵抗、肥胖及生殖內(nèi)分泌失調(diào)是其主要臨床特征，大多數(shù)資料顯示PCOS患者表現(xiàn)出比正常婦女更高的血漿內(nèi)脂素水平，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒并導(dǎo)入PCOS大鼠模型體內(nèi)，研究Visfatin過表達(dá)對(duì)PCOS血漿膽固醇代謝和肝膽固醇合成的影響，從而為PCOS脂代謝異常的調(diào)節(jié)機(jī)理提供進(jìn)一步的研究資料。HMG－CoA還原酶是膽固醇合成的限速酶，膽固醇能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)HMG－CoA還原酶。膽固醇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞內(nèi)的固醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)密切相關(guān)，SREBPs是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇代謝的條件轉(zhuǎn)錄激活因子，介導(dǎo)膽固醇生物合成的反饋調(diào)節(jié)，是調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)脂肪合成的一個(gè)極重要的因子，它通過調(diào)節(jié)與脂肪生成相關(guān)酶(生脂酶)的基因轉(zhuǎn)求而調(diào)節(jié)這些酶的活性，從而控制脂肪合成［4］，是調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝的重要核轉(zhuǎn)錄因子，是脂肪酸代謝中的關(guān)鍵調(diào)控。SREBPs其轉(zhuǎn)錄活性依賴于細(xì)胞膜膽固醇狀態(tài)調(diào)控細(xì)胞膽固醇代謝，當(dāng)細(xì)胞膜膽固醇含量降低的時(shí)候，其表達(dá)增加進(jìn)而促進(jìn)HMG－CoA還原酶、LDL受體等靶基因的表達(dá)，從而升高細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平，達(dá)到對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的有效調(diào)控［5－6］。魏立新［7－8］等對(duì) HMG－CoA還原酶抑制劑對(duì)腎病綜合征大鼠肝臟低密度脂蛋白及高密度脂蛋白受體表達(dá)的影響做過研究，顯示HMG－CoA還原酶抑制劑對(duì)腎病綜合征大鼠肝臟高膽固醇血癥有明顯改善作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，visfatin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后 PT組大鼠HMG－CoA還原酶mRNA及SREBP2 mRNA的表達(dá)升高明顯，NT組HMG－CoA還原酶mRNA的表達(dá)較轉(zhuǎn)染前明顯升高，提示血漿visfatin能上調(diào)還原酶和SREBP－2的表達(dá)，從而促進(jìn)肝臟膽固醇代謝，降低血漿總膽固醇水平。NT組SREBP2 mRNA的表達(dá)較轉(zhuǎn)染前無明顯變化，可能與實(shí)驗(yàn)樣本量有關(guān)系，但至少在PCOS組轉(zhuǎn)染后SREBP2 mRNA的表達(dá)有變化，提示血漿visfatin發(fā)揮促進(jìn)膽固醇代謝的作用，visfatin對(duì)機(jī)體膽固醇代謝具有調(diào)節(jié)作用，能促進(jìn)肝臟膽固醇代謝，從而降低血漿總膽固醇水平。希望以此為引導(dǎo)探究visfatin的影響因素，從而進(jìn)一步了解PCOS，為尋求治療PCOS的途徑提供依據(jù)。

表2 visfatin質(zhì)粒處理對(duì)大鼠肝臟HMG－CoA還原酶、SREBP－2 mRNA表達(dá)量的影響(n=10，±s)

表2 visfatin質(zhì)粒處理對(duì)大鼠肝臟HMG－CoA還原酶、SREBP－2 mRNA表達(dá)量的影響(n=10，±s)

注:與 NE 組比較#P＜0.05

F P HMG－CoA reductase/β2actin 0.50±0.03 0.92±0.10* 0.64±0.21* 0.83±0.12*Group NE NT PE PT 30.000 ＜0.0120.533 ＜0.01 SREBP－2/β2acti 0.38±0.02 0.41±0.04 0.57±0.12* 0.68±0.10*

［1］Fukuhara A，Matsuda M，Nishizawa M，et al.Visfatin:a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin［J］.Science，2005，307:426－430.

［2］Curat CA，Wegner V，Sengenes C，et al.Macrophages in human visceral adipose tissue:increased accumulation in obesity and a source of resistin and visfatin［J］.Diabetologia，2006，49(4):744－747.

［3］廖鑫，郝濤，陽(yáng)琰，等.糖尿病大鼠內(nèi)臟脂肪組織Visfatin mRNA 表達(dá)的研究［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27(8):1356－1358.Liao Xin，Hao Tao，Yang Yan，et al.Expression of visfatin mRNA in visceral adipose of rats with diabetic mellitus［J］.The Journal of Practical Medicine，2011，27(8):1356－1358.

［4］Stoet kman A K，Towle H C.The role of SREBP1 nutritional regulation of lipogenic enzyme gone expression［J］.Biol Chem，2002，277(30):27029－27035.

［5］Adams CM，Reitz J，De Brabander JK，et a1.Cholesterol and 25－h(huán)ydr0xych 0 lester0 l inhibit activation of SREBPs by differentmecha－nisms，both involving SCAP and Insigs［J］.Biol Chem，2004，279(50):52772－52780.

［6］Radhakrishnan A，Sun LP，Kwon HJ，et a1.Direct binding of choles－terol to the purified memb rane region of SCAP:mechanism for a ste－rol－sensing domain［J］.Mol Cell，2004，15:259－268.

［7］魏立新，鄒和群，詹林達(dá).HMG2CoA還原酶抑制劑對(duì)腎病綜合征大鼠肝臟低密度脂蛋白受體表達(dá)的影響［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007，36(2):265－268.

［8］魏立新，鄒和群.HMG2CoA還原酶抑制劑對(duì)腎病綜合征大鼠肝臟高密度脂蛋白受體表達(dá)的影響［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(14):1296－1298.