正交試驗法優(yōu)選丁香葉中總黃酮提取工藝

陳雪英，霍金海，劉芳萍*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省中醫(yī)研究院，哈爾濱 150036）

丁香葉為木樨科植物紫丁香（Syringa oblateLindl）、洋丁香（S.vulgarisL.）和朝鮮丁香（S.dila?tataNakai）干燥葉，具有廣譜抗菌和抗病毒作用。以其為原料生產(chǎn)炎立消膠囊、片劑（收載于中華人民共和國衛(wèi)生部頒藥品質(zhì)量標準）用于治療急性腸炎、菌痢、上呼吸道感染及急、慢性扁桃體炎等感染性疾病，療效顯著[1]。但該產(chǎn)品用一定量藥材原粉入藥，服用量大、溶散時限長短不一、生物利用度低，其提取工藝參數(shù)優(yōu)化是需解決的關(guān)鍵問題之一。

目前關(guān)于丁香葉提取工藝文獻報道較少[2-3]，其中黃酮類為其重要成分，丁香葉中黃酮提取液對白葡萄球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有明顯抑制作用[4]。丁香葉中黃酮類成分提取工藝研究常采用微波法[2]，該方法提取效率高、操作簡便、省時、無污染，但微波萃取上還停留在實驗室小樣品提取及分析階段，設(shè)備簡陋，工業(yè)化微波提取器尚未見報道。

本文以丁香葉有效成分總黃酮為指標，對常用滲漉法、回流法、超聲法進行考查，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)選總黃酮提取工藝，為其生產(chǎn)工藝研究及深層次開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

6000PC型可見紫外分光光度計（購自上海元析儀器有限公司）；KQ-300DB型數(shù)控超聲儀（購自昆山市超聲儀器有限公司）；BP211D型電子天平（購自德國Sartorius公司）；DK-8D型電熱恒溫水槽（購自上海精宏試驗設(shè)備有限公司）。

1.2 材料

蘆丁對照品11040302，供含量測定用（由中國藥品生物制品檢定所提供）；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁，分析純（購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙醇，分析純（購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；丁香葉采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)，經(jīng)鑒定為木樨科植物紫丁香葉，置陰涼通風(fēng)處干燥。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮含量測定方法

1.3.1.1 標準曲線制備

精密稱取蘆丁對照品50 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，得2 mg·mL-1對照品溶液。精密量取對照品溶液1、2、3、4、5與6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不含蘆丁相應(yīng)試劑為空白，照紫外可見風(fēng)光光度法，在510 nm波長處測定吸光度。

1.3.1.2 樣品含量測定

分別精密吸取樣品溶液6 mL，按1.3.1.1條測定，并用回歸方程計算總黃酮含量。

1.3.2 總黃酮提取方法考察

滲漉法：取丁香葉3 g，精密稱定，置于內(nèi)徑為0.5 cm玻璃柱內(nèi)，加60%乙醇浸泡2 h后，以1 mL·min-1度滲漉，共60 mL，收集滲漉液，混勻，精密吸取0.3 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。測定并計算總黃酮含量。

回流法：取丁香葉3 g，精密稱定，加60%乙醇60 mL，回流提取2 h，濾過，精密吸取續(xù)濾液0.3 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。測定并計算總黃酮含量。

超聲法：取丁香葉3 g，精密稱定，加60%乙醇60 mL，超聲處理2 h，濾過，精密吸取續(xù)濾液0.3 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。測定并計算總黃酮含量。

1.3.3 單因素試驗方法

1.3.3.1 乙醇濃度對總黃酮得率影響

精密稱取5份質(zhì)量為3 g丁香葉，分別加入60 mL 20%、40%、60%、80%、100%乙醇，回流提取2 h，濾過，精密吸取續(xù)濾液0.3 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。測定并計算總黃酮含量，研究不同乙醇濃度對總黃酮提取率影響。

1.3.3.2 液料比對總黃酮得率影響

精密稱取5份質(zhì)量為3 g丁香葉，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入60%乙醇溶液，回流提取2 h，濾過，精密吸取續(xù)濾液0.3 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。測定并計算總黃酮含量，研究不同液料比對總黃酮提取率影響。

1.3.3.3 提取時間對總黃酮得率影響

精密稱取5份質(zhì)量為3 g丁香葉，加入60%乙醇溶液60 mL，分別回流提取1、1.5、2、2.5、3 h，濾過，精密吸取續(xù)濾液0.3 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。測定并計算總黃酮含量，研究不同提取時間對總黃酮提取率影響。

1.3.4 正交試驗方法

在單因素試驗基礎(chǔ)上，丁香葉以乙醇濃度A、液料比B、提取時間C為3個考察因素，每個因素選擇3個水平，按L9(34)正交表設(shè)計4因素3水平正交試驗（見表1）。

以總黃酮得率為考察指標，每次試驗重復(fù)3次，取平均值作為結(jié)果，確定從丁香葉中提取總黃酮最佳工藝。

表1 正交因素水平Table 1 Factor levels of design in orthogonal test method

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線繪制

以吸光度值（A）為縱坐標，蘆丁濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線（見圖1），得回歸方程：

y=13.004x-0.0086（r=0.9997）。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of Rutin

2.2 總黃酮提取方法考察結(jié)果與分析

以丁香葉總黃酮得率為指標，考察滲漉法、回流法和超聲法3種不同提取方法對總黃酮得率影響（見圖2）。

圖2 提取方法對總黃酮得率影響Fig.2 Effect of the extraction method on total flavonoids yield

由圖2可知，滲漉法提取效率較低，回流法和超聲法提取效率均較高，說明加熱和超聲波輔助方式均能增加丁香葉中黃酮類物質(zhì)溶出，本文選擇回流法作進一步研究。

2.3 單因素試驗結(jié)果與分析

2.3.1 乙醇濃度對總黃酮得率影響

以丁香葉總黃酮得率為指標，分別以20%、40%、60%、80%、100%乙醇回流提取，乙醇濃度對總黃酮得率影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對總黃酮得率影響Fig.3 Effect of the ethanol concentration on total flavonoids yield

由圖3可知，用濃度40%～80%乙醇提取總黃酮得率較高，而在乙醇濃度為20%及100%時，總黃酮得率較低。這可能是由于總黃酮包含黃酮苷及苷元兩部分組成，20%乙醇對苷元溶解度較低，100%乙醇對黃酮苷溶解度較低，故選擇乙醇濃度為40%～80%作進一步研究。

2.3.2 料液比對總黃酮得率影響

第二，依法嚴厲打擊貪腐造假等不法行為以營造合法謀利的社會氛圍，提供起點公平、程序公正、機會均等的競爭環(huán)境。當下中國，“漂族”、“蝸居”、“蟻族”人群大量出現(xiàn)，使人們不安全感加重；房難買、學(xué)難上、病難看的現(xiàn)實矛盾，讓人的不確定感增強；而少數(shù)干部的貪污腐敗、一些地方的暗箱操作，使干群關(guān)系變得緊張而不信任。［14］為什么這些現(xiàn)象難以消除并激化人心？就因為缺少一個合法謀利的社會環(huán)境及氛圍。人人都想著如何參與財富的分配而不是財富的創(chuàng)造，則追求滿足的行為很容易蛻變?yōu)樨澑旒俚牡満Α?/p>

以丁香葉總黃酮得率為指標，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入60%乙醇溶液回流提取，料液比對總黃酮得率影響見圖4。

由圖4可知，料液比1∶15～1∶25，總黃酮得率增加幅度最大，而料液比1∶30與1∶25相比，總黃酮得率增加幅度不大，均比料液比1∶10得率高。這是由于丁香葉質(zhì)地蓬松，料液比1∶10溶媒較少，無法浸沒藥材，未能與乙醇接觸完全，導(dǎo)致有效成分浸出不完全。而1∶30溶媒量較大，給后續(xù)回收工藝帶來困難，故設(shè)定料液比為1∶15、1∶20、1∶25作進一步研究。

2.3.2 提取時間對總黃酮得率影響

以丁香葉總黃酮得率為指標，60%乙醇溶液分別回流提取1、1.5、2、2.5、3 h，提取時間對總黃酮得率影響見圖5。

圖4 料液比對總黃酮得率影響Fig.4 Effect of the material-liquid rate on total flavonoids yield

圖5 提取時間對總黃酮得率影響Fig.5 Effect of the extraction time on total flavonoids yield

由圖5可知，隨著提取時間延長，總黃酮得率逐步提高，但3 h后，得率略有降低，是長時間回流對黃酮類成分產(chǎn)生影響，故選擇提取時間1.5 h～2.5 h作進一步研究。

2.4 正交試驗結(jié)果與分析

以總黃酮得率為考查指標，結(jié)果見表2，D項為空白項，作方差分析。對表2進行統(tǒng)計學(xué)處理并方差分析（見表3）。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

3 討論與結(jié)論

天然黃酮類化合物提取方法包括溶劑提取法、微波提取法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法等。在提取方法設(shè)計過程中，對各類方法優(yōu)缺點進行充分考慮。溶劑提取法是目前黃酮類化合物常用提取方法，分為冷浸法、滲漉法、回流法。其中冷浸法效率較低，故本文考查滲漉法、回流法。

超聲波提取操作簡便、無需加熱、提出率高、速度快，近年來在黃酮類化合物提取過程中，顯示出明顯優(yōu)勢，本文將其列為考查方法之一。微波提取法具有選擇性高、操作時間短、溶劑耗量少、有效成分得率高特點，國內(nèi)外學(xué)者對其在黃酮提取進行大量報道，但僅限于試驗研究，其設(shè)備推廣及產(chǎn)業(yè)化仍需進一步研究。

超臨界流體萃取具有傳質(zhì)速度快、溶解能力強、低溫操作、節(jié)能等優(yōu)點，用該技術(shù)提取天然產(chǎn)物有效成分成為研究熱點，由于產(chǎn)業(yè)化設(shè)備一次性投入昂貴，目前在我國中藥制藥企業(yè)實際應(yīng)用較少。因此，本試驗最終選擇滲漉法、回流法、超聲法進行研究。

在正交設(shè)計過程中，考慮到溶媒濃度、用量、提取時間、提取次數(shù)4個因素為影響溶液提取法主要因素。在文獻報道中，可見部分試驗采用L9（34）正交，4個因素全部安排在表中，將提取次數(shù)設(shè)為D項，影響較小，可近似替代隨機誤差項進行統(tǒng)計分析。將D項設(shè)為空白，在無處理因素下產(chǎn)生隨機誤差，作為各處理因素比對基準，試驗設(shè)計更為嚴謹。提取次數(shù)一般與前3個因素?zé)o交互作用，可根據(jù)實際生產(chǎn)中含量、固形物得率等具體需求而設(shè)定。

本試驗結(jié)果表明，乙醇回流法及超聲法同樣具有較高提取效率。因乙醇回流法是中藥制劑生產(chǎn)中最常用提取方法，故本文對其進行進一步優(yōu)化研究，超聲法雖省時省力，節(jié)約能源，但不適合大生產(chǎn)，建議在實驗室研究中采用。在本試驗優(yōu)化條件下，丁香葉總黃酮最高含量為118 mg·g-1，與文獻[2]微波法提取結(jié)果有較大差異。原因可能除提取方法本身差異外，丁香葉產(chǎn)地，采集時間是影響試驗結(jié)果主要因素，因此應(yīng)進一步對不同產(chǎn)地、不同采集時期丁香葉進行系統(tǒng)品質(zhì)評價研究，得出科學(xué)結(jié)論。

本研究選用乙醇回流法作為丁香葉提取方法，并采用正交試驗法優(yōu)化試驗條件，提高丁香葉中總黃酮提取效率，含量達100 mg·g-1以上（相當于生藥量），為提取丁香葉有效部位提供科學(xué)、可靠方法。此工藝符合制藥企業(yè)生產(chǎn)實際情況，可推廣、應(yīng)用并改進，為丁香葉深層次開發(fā)利用提供參考。

[1]王錄娜,李永吉,管慶霞,等.丁香葉研究現(xiàn)狀及展望[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(4)∶963-964.

[2]李娜,毛永強.微波提取紫丁香葉總黃酮工藝研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(12)∶121-123.

[3]蘭掀,王昶,朱廣偉.丁香葉中丁香酚提取方法比較[J].黑龍江醫(yī)藥,2006,19(1)∶19-20.

[4]常麗新,賈長紅,高曼.丁香葉黃酮抑菌作用研究[J].食品工藝科技,2010(10)∶126-128.

[5]喻林華,方晰,田春燕,等.正交試驗優(yōu)選薄荷總黃酮超聲提取工藝研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2012,32(8)∶94-97.

[6]許勇,郭興杰,范捷,等.正交設(shè)計研究補骨脂中總黃酮提取工藝[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2003,20(2)∶145-147.

[7]常纓,胡金良,姜述君,等.南京市紫金山藥用蕨類植物資源分布及其總黃酮含量測定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,36(3)∶320-323.

[8]張英華,關(guān)雪.刺五加葉中黃酮類提取物抗氧化性及抑菌作用研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,43(3)∶85-90.

[9]鄧祥元,沙鵬,高坤.微波輔助萃取蠶沙葉綠素工藝研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,43(8)∶12-16.

[10]Sun D X,Dong L H,Guo P P.Simultaneous detection of flavo?noids and phenolic acids inHerba lysimachiaeandHerba desmo?dii Styracifoliiusing liquid hromatography tandem mass spectrom?etry[J].Food Chemistry,2013,138∶139-147.

[11]Jeevan K.Prasain,Chao C,et al.Mass spectrometric methods for the determination of flavonoids in biological samples[J].Free Rad?ical Biology and Medicine,2004,37(9)∶1324-1350.

[12]Sha C N,Ben H Wub.Analysis of flavonoids from lotus(Nelumbo nucifera)leaves using high performance liquid chromatography/photodiode array detector tandem electrospray ionization mass spectrometry and an extraction method optimized by orthogonal design[J].Journal of Chromatography A,2012,1227∶145-153.

[13]李鳳林,李青旺,馮彩寧,等.天然黃酮類化合物提取方法研究進展[J].中國食品添加劑,2008(5)∶60-64.