肉羊心型脂肪酸結(jié)合蛋白基因第2外顯子多態(tài)性與肉質(zhì)性狀相關(guān)分析

曹 陽，趙 雪,，于永生，張立春，郭振剛，金海國

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院，吉林 公主嶺 136100；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春 130118）

肉品質(zhì)是一個復(fù)雜經(jīng)濟(jì)性狀，肌內(nèi)脂肪是影響肉品質(zhì)量和風(fēng)味的重要指標(biāo)之一。肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat,IMF）含量直接影響肉品質(zhì)和風(fēng)味，特別是肉多汁性[1-2]。

脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty acid binding protein,FABP）是一族同源性較高小分子細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，在心肌、小腸、肝臟、脂肪組織、腦、表皮等組織細(xì)胞中均存在，在脂類代謝過程中起重要作用。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（Heart fatty acid binding pro?tein,H-FABP）與脂肪酸結(jié)合密切相關(guān)。目前，豬、雞、牛、羊等畜禽H-FABP基因已經(jīng)被相繼克隆和定位，并有研究表明H-FABP基因可作影響IMF含量候選基因[3-7]。本試驗(yàn)采用PCR-SSCP方法檢測杜泊×小尾寒羊H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性，并與肉質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)分析，以期發(fā)現(xiàn)相關(guān)位點(diǎn)用于肉羊育種。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

杜泊×小尾寒羊雜交羊29只，統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院羊場，頸靜脈采血9 mL左右，ACD抗凝帶回實(shí)驗(yàn)室，用AxyPrep血基因組DNA小量制備試劑盒提取血液基因組DNA，1%瓊脂糖電泳檢測基因完整性及純度，-20℃冷凍保存。

1.2 引物設(shè)計與合成

參考綿羊H-FABP基因序列（GenBank登錄號：AY157617）設(shè)計H-FABP基因exon 2引物，引物序列為：F：5'AGCTCATGCTCATACCCTTC 3'，R：5'CCCTCAAGGTGCAACAAT 3'，擴(kuò)增片段長度為285 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包括10×PCR Buffer 1.5 μL，上、下游引物（10 pmol·L-1）各0.5 μL，dNTP（10 mmol·μL-1）0.5 μL，Taq DNA Poly?merase（2.5 U · μL-1）0.5 μL， DNA 模 板（50～100 ng·μL-1）1.0 μL，ddH2O 補(bǔ)至 25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min,4℃保存，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 SSCP檢測

取2 μL PCR產(chǎn)物，加入5 μLLoading buffer,混勻，98℃變性10 min，然后迅速冰浴10 min，變性后PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr:Bis=29∶1）在1×TBE電泳液中進(jìn)行檢測。電泳條件為溫度4℃、電壓150 V，12～14 h。銀染顯色后，進(jìn)行基因分型，不同基因型純合子進(jìn)行測序比對。

1.5 肉質(zhì)、脂肪酸和氨基酸測定

29只杜泊×小尾寒羊雜交羊進(jìn)行屠宰，并測定肉質(zhì)性狀，包括pH、失水率、熟肉率和剪切力，測定方法參照文獻(xiàn)[8]，并且在屠宰過程中取12～13肋骨處背最長肌，用自封袋封好后送往吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所測量脂肪酸和氨基酸含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)基因分型結(jié)果計算基因型頻率和基因頻率，并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。利用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對各生產(chǎn)性狀進(jìn)行方差分析，不同標(biāo)記基因型之間生產(chǎn)性狀指標(biāo)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-SSCP檢測結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，無非特異性條帶，可以用于SSCP分析。PCR-SSCP檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3種基因型AA、BB和AB（見圖1）。

2.2 序列分析結(jié)果

利用DNAStar 7.0軟件與綿羊H-FABP基因序列（GenBank登錄號：AY157617）比對發(fā)現(xiàn)，AA基因型與BB基因型均在在778位置發(fā)生堿基C缺失。AA基因型在1013處發(fā)生A→C突變，BB基因型在第939處、980處和1018處分別發(fā)生A→G、G→A和A→C單堿基突變。

圖1 H-FABP基因PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳和SSCP檢測結(jié)果Fig.1 1%agarose gel electrophoresis and SSCP test results of PCR products in H-FABP gene

2.3 基因型頻率和基因頻率

經(jīng)SSCP分型后計算基因型頻率和等位基因頻率，結(jié)果見表1。由表1可知，B等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因，基因型BB為優(yōu)勢基因型，并且經(jīng)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，杜泊×小尾寒羊雜交羊處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.4 不同基因型對肉質(zhì)、脂肪酸、氨基酸性狀影響

表2結(jié)果表明，不同肉質(zhì)性狀均值差異顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同基因型剪切力存在顯著差異，即基因型BB顯著低于AB型（P＜0.05），說明基因型BB對剪切力有一定負(fù)效應(yīng)。

表3為H-FABP基因不同基因型各脂肪酸性狀均值差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，不同基因型棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸存在顯著差異：基因型BB在棕櫚酸含量上顯著高于AA和AB型（P＜0.05），說明基因型BB對棕櫚酸含量有顯著正效應(yīng)（P＜0.05）；基因型BB在硬脂酸、亞油酸含量上極顯著低于AA、AB型（P＜0.01），AA和AB型之間差異不顯著，說明BB型對硬脂酸、亞油酸含量有極顯著負(fù)效應(yīng)。

H-FABP基因各基因型之間不同氨基酸含量均值差異顯著性比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表4），不同基因型谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和脯氨酸含量存在顯著性差異?；蛐虯A、AB在谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸含量以及氨基酸總和上顯著高于BB型（P＜0.05），說明BB型對谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸含量、氨基酸總和有顯著負(fù)效應(yīng)；基因型BB在脯氨酸含量上極顯著低于AA、AB型（P＜0.01），說明BB型對脯氨酸含量有極顯著負(fù)效應(yīng)。

表1 杜泊×小尾寒羊雜交羊H-FABP基因exon2基因型頻率及等位基因頻率分布Table 1 Distribution of genotype and allele frequencies at the exon 2 of H-FABP gene in Dorper×Small-Tailed Han sheep

表2 H-FABP基因各基因型肉質(zhì)性狀均值差異顯著性檢驗(yàn)Table 2 Significance test of meat trait means for different genotypes of H-FABP gene

表3 H-FABP基因各基因型脂肪酸性狀均值差異顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test of fatty acid means for different genotypes of H-FABP gene

表4 H-FABP基因各基因型氨基酸均值差異顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance test of amino acids means for different genotypes of H-FABP gene

3 討論與結(jié)論

H-FABP主要在脂肪代謝中起作用，參與長鏈脂肪酸攝取或利用，把脂肪酸從細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)骄€粒體β氧化位點(diǎn)[9]。此外，通過與脂酰輔酶A和酰基-L-肉堿綁定長鏈脂肪酸胞內(nèi)運(yùn)輸，H-FABP基因也參與胞質(zhì)疏水配體結(jié)合蛋白和脂質(zhì)代謝[10]。目前H-FABP基因與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析多見于豬和雞上。李武峰等在不同品種牛群體中發(fā)現(xiàn)H-FABP基因多態(tài)性對嫩度有一定影響[11-12]；余剛等研究表明H-FABP基因可以作為陜北白絨山羊生長及胴體性狀候選基因以及絨山羊肉用性能分子標(biāo)記[13]；關(guān)于羊H-FABP基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀關(guān)系報道較少，本研究進(jìn)行H-FABP基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)BB基因型對剪切力有顯著負(fù)效應(yīng)，剪切力越大，嫩度越差，所以說BB基因型對嫩度有顯著正效應(yīng)，這與李武峰和周國利結(jié)果相似。應(yīng)用此標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助育種將有望提高羊肉嫩度，但還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

研究表明不飽和脂肪酸（如油酸、亞油酸和亞麻酸等）含量與肌肉風(fēng)味和營養(yǎng)價值顯著相關(guān)[14]。本研究中在肌肉組織中不飽和脂肪酸含量高于飽和脂肪酸含量，這可能是羊肉特有風(fēng)味物質(zhì)基礎(chǔ)。飽和脂肪酸含量主要取決于棕櫚酸和硬脂酸含量，棕櫚酸含量與多汁性呈負(fù)相關(guān)；硬脂酸可引起羊肉膻味，并且隨著含量升高而增加[15,16]。本試驗(yàn)對不同基因型脂肪酸含量進(jìn)行研究，不同基因型棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸含量存在顯著性差異，其結(jié)果對進(jìn)一步研究H-FABP基因與脂肪酸含量關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

H-FABP基因各基因型之間不同氨基酸含量顯著性比較結(jié)果表明，不同基因型間谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸含量以及氨基酸總和存在顯著性差異，說明H-FABP基因?qū)Π被岷坑幸欢ㄓ绊?。氨基酸中絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸和脯氨酸是形成肉香味所必需前體氨基酸，尤其谷氨酸是肉中最主要鮮味物質(zhì)[17]，本試驗(yàn)中不同基因型谷氨酸含量最高，而谷氨酸可增加羊肉鮮味和香味[18]，由此說明HFABP基因?qū)ρ蛉怩r味和香味有影響，

通過對與生產(chǎn)性狀有顯著相關(guān)的位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，將導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)性狀性能產(chǎn)生遺傳反應(yīng)。但由于試驗(yàn)方法及判型標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)計方法不同，結(jié)論存在差異，需要盡快尋求一種更為靈敏的通用檢測方法及分析手段進(jìn)一步驗(yàn)證，以獲得可靠數(shù)據(jù)用于生產(chǎn)。

[1] 王蘭萍,耿榮慶,冀德君,等.江蘇地方山羊品種H-FABP基因SNPs檢測及群體遺傳學(xué)分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2012,39(3):159-161.

[2] 喬海云,趙倩君,姚娜,等.綿羊H-FABP基因單核苷酸多態(tài)性研究[J].遺傳,2009,31(7):725-731.

[3] Gerbens F,Van A E,Harders F L,et al.Effect of genetic variants of the heart fatty acid-binding protein gene on intramuscular fat and performance traits in pigs[J].Journal of Animal Science,1999,77(4):846-852.

[4] Gerbens F,Verburg F J,Van H M,et al.Associations of heart and adipocyte fatty acid-binding protein gene expression with intra?muscular fat content in pigs[J].Journal of Animal Science,2001,79(2):347-354.

[5] 李文娟,李宏賓,文杰,等.雞H-FABP和A-FABP基因表達(dá)與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2006,37(5):417-423.

[6] 郝莉,李齊發(fā),喬永,等.湖羊肌肉組織H-FABP和PPARγ基因表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(11):3776-3783.

[7] 姜延志,劉曉研,李芳瓊,等.豬H-FABP基因多態(tài)性及其與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2010,41(7):792-796.

[8] 趙有璋.羊生產(chǎn)學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2005.

[9] Gerbens F,Verburg F J,Van Moerkerk H T B,et al.Associations of heart and adipocyte fatty acid-binding protein gene expression with intramuscular fat content in pigs[J].J Anim Sci,2001,79:347-354.

[10] Glatz J F,Schaap F G,Binas B,et al.Cytoplasmic fatty acidbinding protein facilitates fatty acid utilization by skeletal muscle[J].Acta Physiol Scand,2003,178:367-371.

[11] 李武峰,許尚忠,曹紅鶴,等.3個雜交牛種H-FABP基因第二內(nèi)含子遺傳變異與肉品質(zhì)性狀相關(guān)分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2004,35(3):252-255.

[12] 周國利,朱奇,郭善利,等.魯西黃牛H-FABP基因多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀關(guān)系分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2005,14(3):5-7.

[13] 余剛,羅軍,韓雪峰,等.陜北白絨山羊H-FABP基因SNPs及其與生長、胴體性狀相關(guān)研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2007,38(11):1154-1159.

[14] Lunt D K,Smith S B.Wagyu beef holds profit potential for US[J].Feedlots,1991,(8):18.

[15] 馬文習(xí).脂蛋白與載脂蛋白[J].生物學(xué)通報,1998,33(6):17-18.

[16] 錢文熙.灘羊肉品質(zhì)研究[D].銀川:寧夏大學(xué),2005.

[17] 宋社果,安小鵬,趙海波,等.藏香豬屠宰特性及肉品質(zhì)分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,20(12):26-32.

[18] 熱孜瓦古麗·米吉提,買買提伊明·巴拉提,依巴代提·米吉提,等.綿羊羊肉氨基酸成分比較研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,49(8):1552-1556.