江蘇省淡水產(chǎn)品中主要弧菌菌群的RAPD分型

高 璐， 唐 偉， 楊振泉， 杭 莉， 高 崧， 方維明

(1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127;2.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009;3.泰州市出入境檢驗檢疫局，江蘇 泰州 225300;4.泰州市疾病預防控制中心，江蘇 泰州 225300)

弧菌廣泛存在于水產(chǎn)品中，現(xiàn)報道的共有200多種。其中，有12種對人體具有很強的致病性，可引起人體嚴重腹瀉或者傷口感染、中耳炎及敗血癥等［1］。近年來，有關此類的食物中毒事件的案例不斷增加，因而對消費者的健康構成潛在的威脅［2］。副溶血弧菌和溶藻弧菌是2種重要的致病菌種，通常認為他們是條件致病菌，是引起海洋魚類和無脊椎動物大量死亡的主要原因，并且每年導致全世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大量的經(jīng)濟損失［3-6］。

微生物分型技術是進行食品中微生物檢測和流行病學研究中必不可少的工具，但研究結(jié)果表明傳統(tǒng)的血清分型、表型分型技術在環(huán)境和流行病學調(diào)查分析中具有局限性。分子分型方法以其高靈敏性、高分型率等優(yōu)點被廣泛應用于弧菌的分型和診斷中。隨機擴增多態(tài)性DNA技術(Random amplified polymorphic DNA，RPAD)是以PCR為基礎的分子標記技術，是Williams等［7］和 John 等［8］建立的一種新的揭示基因組多態(tài)性的方法，所需要的引物無需專門設計，模板DNA用量少，靈敏度高，已被廣泛地應用于生物的遺傳多樣性和種群的遺傳、分類及親緣關系等研究。

本研究對從江蘇省部分地區(qū)淡水產(chǎn)品中分離到的59株副溶血弧菌和107株溶藻弧菌的全基因組進行了RAPD分析，旨在探討其種內(nèi)各分離株間的親緣關系和分子特性，為監(jiān)測流行株、及時準確確立污染源、調(diào)查傳播途徑的研究提供依據(jù)，也為有效預防控制弧菌引起的腹瀉及食物中毒事件提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 所用菌株均分離自江蘇省連云港、揚州、泰州、常州地區(qū)的魚、蝦、蟹、貝等淡水產(chǎn)品，由揚州大學食品科學與工程學院發(fā)酵微生物實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 TCBS瓊脂購于杭州微生物試劑有限公司;PCR所用生物試劑(10×Buffer、RNase、Taq 酶、dNTPs、DNA Marker)均為上海生工生物工程技術有限公司產(chǎn)品。

SPX-250-250B-Z型生化培養(yǎng)箱(購自上海博訊公司)，PTC-100 PCR儀(購自美國MJ公司)，DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(購自北京市六一儀器廠)，TG16-WS型高速離心機(購自湘儀離心機儀器有限公司)，GELDOCXR凝膠成像系統(tǒng)(購自BIO-RAD公司)。

1.2 弧菌基因組DNA提取

參照文獻［9］和《精編分子生物學實驗指南》的CTAB法提取弧菌分離株基因組DNA。

1.3 RAPD 擴增體系

參照文獻［9］，選取2條隨機引物(AP11:5'-GGGAACGTGT-3';AP21:5'-AATCGGGCTG-3')進行隨機多態(tài)性擴增試驗。

RAPD擴增反應體系:模板(100 ng/μl)1.0 μl、dNTPs(10 mmol/L)0.5 μl、隨 機 引 物 (10 pmol/μL)2.0 μl、10 × Buffer 2.5 μl、MgCl2(25 mmol/L)2.0 μl、Taq 酶 (5 U/μl)0.3 μl、ddH2O 15.7 μl，總體積 25.0 μl。

RAPD熱循環(huán)參數(shù):94℃ 3 min，36℃ 1 min，72℃ 2 min，1次循環(huán);94℃ 1 min，36℃ 55 s，72℃ 2 min，35次循環(huán);94 ℃ 1 min，36 ℃ 55 s，72 ℃ 10 min，1 次循環(huán)。

擴增產(chǎn)物的檢測:取10.0 μl產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳(電壓5 V/cm)1.5 h，電泳結(jié)束后經(jīng)溴化乙錠染色20 min，在凝膠成像系統(tǒng)上進行觀察并拍照。根據(jù)條帶清晰程度，彌散背景情況以及帶型強弱選擇圖片進行分析。

1.4 RAPD重復性試驗

取不同的分離株，每個菌株利用上述建立和優(yōu)化的系統(tǒng)分別獨立進行RAPD-PCR擴增3次，并分析擴增譜帶的穩(wěn)定性和重復性。

1.5 RAPD指紋圖譜分析

電泳圖中相同遷移位置上有條帶的記1、無條帶的記0，以1、0數(shù)列矩陣形式記錄PCR產(chǎn)物的擴增位點。利用Popgene 32軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得出Nei's基因多樣度、Shannon's信息指數(shù)、遺傳相似度、遺傳距離等數(shù)據(jù)，并根椐遺傳距離利用Mega 4構建UPGMA系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 RAPD擴增重復性試驗

對于各分離株進行3次RAPD擴增，電泳結(jié)果如圖1所示，3次擴增獲得的指紋基本一致，顯示指紋圖譜具有較好的穩(wěn)定性和可重復性。

圖1 RAPD指紋圖譜分型Fig.1 The repeated amplification of the isolates by RAPD

2.2 副溶血弧菌RAPD分型

應用RAPD分型方法對59株副溶血弧菌分離株進行分析，2種不同隨機引物AP11、AP21的擴增譜帶模式如圖2所示。AP11擴增得到8個不同的指紋圖譜(圖2A)，其中，菌株分布最集中的是1型、4型和 7型，所占的比例分別為32.8%(19/59)、25.4%(15/59)和 22.0%(13/59);AP21擴增得到7個不同的指紋圖譜(圖2B)，其中，菌株分布最集中的是a型、c型和d型，所占的比例分別為39.0%(23/59)、27.1%(16/59)和15.3%(9/59)(表 1)。

圖2 副溶血弧菌RAPD譜帶Fig.2 RAPD patterns of V.parahaemolyticus isolates

按照每個菌株的2種譜帶模式組合進行基因分型，共獲得了18個基因型別(表1)，其中1a、4a、7d為主要型別，所占比例分別為 16.9%、15.3%、10.2%。根據(jù)分子指紋圖譜計算Nei氏相似系數(shù)，通過UPGMA聚類分析，繪制系統(tǒng)進化樹(圖3)進一步表明，18個分子型在相似性80%的基礎上可分為A至I 9個遺傳譜系，其中A型和C型是副溶血弧菌的主要型別，屬于A型的有17株分離株、C型的有19株，分別占總分離株的28.8%和32.2%，且A型和C型副溶血弧菌在所有采樣地區(qū)和樣品種類中均有檢出(表2)。

圖3 副溶血弧菌分離株的RAPD指紋圖譜聚類分析圖Fig.3 The clustering analysis of RAPD patterns of V.parahaemolyticus isolates

表2 副溶血弧菌在不同地區(qū)、樣品中的分布Table 2 Distribution of different genotypes of V.parahaemolyticus isolates in four samples from all four areas

2.3 溶藻弧菌RAPD分型

應用隨機引物AP11、AP21對107株溶藻弧菌分離株進行隨機多態(tài)性擴增分析，不同隨機引物的譜帶擴增模式如圖4所示。AP11擴增得到11個不同的指紋圖譜(圖4A)，其中，菌株分布最集中的是1型、8型和10型，所占比例分別為29.0%(31/107)，15.0%(16/107)和32.7%(35/107);AP21擴增得到6個不同的指紋圖譜(圖4B)，其中，菌株分布最集中的是a型、c型和f型，所占比例分別為50.5%(54/107)，19.6%(21/107)和16.8%(18/107)(表3)。

圖4 溶藻弧菌RAPD譜帶Fig.4 RAPD patterns of V.alginolyticus isolates

按照每個菌株的2種譜帶模式組合進行基因分型，共獲得了21個基因型別(表3)，其中1a、8c、10a和10f為主要型別，所占比例分別為22.4%、13.1%、19.6和11.2%。根據(jù)分子指紋圖譜計算Nei氏相似系數(shù)，通過UPGMA聚類分析，繪制系統(tǒng)進化樹(圖5)進一步表明，21個分子型在相似性80%的基礎上可分為A至I 12個遺傳譜系，其中A型是溶藻弧菌的最主要型別，含分離株50株，占總分離株的46.7%。溶藻弧菌的譜系A和K在所有采樣地區(qū)和樣品中均有檢出(表4)。

表4 溶藻弧菌在不同地區(qū)、樣品中的分布Table 4 Distribution of different genotypes of V.alginolyticus in four samples from all four areas

圖5 溶藻弧菌分離株的RAPD指紋圖譜聚類分析圖Fig.5 The clustering analysis of RAPD patterns of V.alginolyticus isolates

表3 不同來源的溶藻弧菌分離株的RAPD分型結(jié)果Table 3 Results of RAPD genotyping differently-originated V.alginolyticus isolates

3 討論

隨著分子生物學技術的發(fā)展，在基因型方面的分子分型技術已經(jīng)得到了廣泛的應用。目前，弧菌中應用最多的是以脈沖凝膠電泳分析(PFGE)為首的分子分型方法，但是其分型成本高、操作費時而且技術復雜，不適用于大量樣品的快速分型［10］。

RAPD技術具有個體、種群、亞種和種等各層次水平上的特異性，且操作簡單，所需要引物不需要專門設計，適用于大量樣品的快速分型，尤其是在疾病暴發(fā)流行時，它是分析相關菌株和排除不相關菌株的良好基礎，已廣泛應用于遺傳多樣性、分類及親緣關系等領域的研究［11］。

本研究在我們已建立的副溶血弧菌RAPD分型技術的基礎上，選取了AP11、AP21 2條隨機引物，對不同來源的副溶血弧菌和溶藻弧菌進行分型，結(jié)果顯示，AP11、AP21 2條引物將59株副溶血弧菌分為18個譜型，將107株溶藻弧菌分為21個譜型，顯示了副溶血弧菌和溶藻弧菌均具有較好的基因多樣性，這與Sudheesh等［12］的研究基本一致。

從弧菌的地理分布上看，連云港地區(qū)樣品中分離到的副溶血弧菌和溶藻弧菌具有豐富的多態(tài)性，其譜帶模式均多于揚州、泰州、常州地區(qū)樣品中分離株。這可能與連云港所處的沿海地理位置相關，易與海產(chǎn)品發(fā)生相互交叉污染，或是沿海入口的生存環(huán)境(如鹽度、溫度等)更易于弧菌的生長，我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)連云港地區(qū)樣品中弧菌的多樣性比揚州、泰州、常州地區(qū)豐富［13］。

從弧菌的樣品來源上看，在魚、蟹和蝦這3類樣品中，副溶血弧菌和溶藻弧菌均顯示了較好的多態(tài)性，魚和蝦樣品中分離株的指紋譜帶模式較為接近，而在貝類樣品中的指紋圖譜譜帶比較單一，這可能與這些水生動物的生活習性有關，也可能與我們樣品數(shù)量有限所致。因而，我們?nèi)孕柽M一步的研究以了解他們之間的相關性。對這些不同地區(qū)不同樣品的主要攜帶型別進行深入的研究，將為水產(chǎn)品中污染源的溯源及水產(chǎn)養(yǎng)殖中疾病傳染的控制提供重要的依據(jù)。

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