畢赤酵母表達(dá)人溶菌酶基因的初步研究

王安平， 朱善元， 王永娟， 吳 雙， 左偉勇， 洪偉鳴

(江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300)

溶菌酶(LYZ)是1922年由英國科學(xué)家Fleming首先在人的唾沫、眼淚和鼻涕中發(fā)現(xiàn)的，因其可使細(xì)菌細(xì)胞壁溶解而得名［1］。它能切斷肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵的聯(lián)結(jié)，破壞肽聚糖支架，在內(nèi)部滲透壓的作用下細(xì)胞脹裂開，引起細(xì)菌裂解，有些革蘭氏陰性菌也會(huì)受到溶菌酶的破壞。人和動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)亦無肽聚糖，故溶菌酶對(duì)人體細(xì)胞無毒性作用［2］。

人溶菌酶(hLYZ)屬于c型溶菌酶，即雞卵清溶菌酶(cLYZ)，由130個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為14 700。參與機(jī)體的防御機(jī)制，有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值［3］。通常人溶菌酶是從人乳或胎盤中少量提取，由于來源困難，提取方法復(fù)雜，不能進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。采取DNA重組技術(shù)，從原核或真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)人溶菌酶是解決其供需矛盾的有效途徑。畢赤酵母是目前最為成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，迄今為止已成功地表達(dá)了100多種外源蛋白質(zhì)［4］。本研究通過基因工程手段，利用畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)具有生物活性且易于純化的人溶菌酶，為人溶菌酶的規(guī)?；_發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和載體 含人溶菌酶基因的真核表達(dá)質(zhì)粒p215C3-LYZ、酵母表達(dá)載體pPIC9K和酵母株GS115由本實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存;微球菌由揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物教研組提供。

1.1.2 酶和試劑 Prime STAR HS DNA高保真聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ及DNA連接酶購自大連寶生物公司;Wizard DNA純化試劑盒購自美國Promega公司;氨基糖甙類抗生素G418購自Americo公司;hLYZ單抗購自Abcam公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.1.3 PCR引物合成 根據(jù)已發(fā)表的hLYZ(NM_000239)基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，并在其兩端分別引入EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)，其序列分別為:正向引物5'-GGTGAATTCAAGGTCTTTGAAAGGTGTG-3'和反向引物5'-GTTGCGGCCGCCACTCCACAACCTTGAACA-3'。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 hLYZ基因的獲得 以本實(shí)驗(yàn)室保存的含人溶菌酶基因的重組質(zhì)粒p215C3-LYZ為模板擴(kuò)增人溶菌酶基因。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，按Wizard DNA Clean-up System試劑盒說明書進(jìn)行純化回收目的基因。

1.2.2 畢赤酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶EcoR I和NotⅠ酶切回收的PCR產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳分離和回收后，與用同樣酶切線性化的畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在含100 μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上37℃培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落，提取質(zhì)粒電泳篩選，并進(jìn)行酶切鑒定。酶切鑒定正確后送由上海生工公司測(cè)序。

1.2.3 畢赤酵母宿主菌電轉(zhuǎn)化 用SacⅠ酶切線性化pPIC9K-LYZ質(zhì)粒，純化回收并將其濃度調(diào)整為 1 μg/μl。將 10 μl pPIC9K-LYZ 與 80 μl GS115感受態(tài)細(xì)胞混合，1 500 V電擊5 ms;電擊后酵母細(xì)胞涂布于MD平板上，30℃靜置培養(yǎng)2～3 d，直至長出白色菌落。

1.2.4 重組酵母菌株高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選及甲醇利用型鑒定 無菌條件下，用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板對(duì)陽性克隆進(jìn)行連續(xù)傳代，使細(xì)胞濃度達(dá)到一致，充分懸浮細(xì)胞，用微量移液器吸取5 μl細(xì)胞懸液分別滴加于含 0.25 mg/ml、0.50 mg/ml、0.75 mg/ml、1.00 mg/ml、1.50 mg/ml、2.00 mg/ml、3.00 mg/ml、4.00 mg/ml G418的YPD平板，30℃靜置培養(yǎng)2～5 d，篩選得到高拷貝克隆子。將篩選到的高拷貝克隆子分別接種MD和MM平板，30℃靜置培養(yǎng)3 d，如果兩種平板上均生長良好，則為Mut+型轉(zhuǎn)化菌，僅MD板上生長良好而MM板上生長較差的為Muts型轉(zhuǎn)化菌。

1.2.5 PCR檢測(cè)hLYZ基因與畢赤酵母染色體基因組的整合 按照Invitrogen公司提供的方法，提取高拷貝重組畢赤酵母菌總DNA，以通用引物5'-AOX和3'-AOX PCR法檢測(cè)hLYZ基因與畢赤酵母染色體基因組的整合，以pPIC9K空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母菌作陰性對(duì)照。

1.2.6 重組酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá) 取少量甘油保存的高拷貝GS115轉(zhuǎn)化子接種于5 ml YPD培養(yǎng)基中，200 r/min轉(zhuǎn)速30℃培養(yǎng)過夜;按1∶100的比例接種于BMGY培養(yǎng)基，200 r/min 30℃培養(yǎng)24 h;室溫下3 000 g離心5 min，收獲細(xì)胞沉淀，用1/4體積含0.5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)，為了增加通氣量，用紗布封口。每隔24 h取上清以備分析，并添加甲醇至終濃度為0.5%繼續(xù)誘導(dǎo)。

1.2.7 重組蛋白質(zhì)的SDS-PAGE和Western blot鑒定 將高拷貝重組酵母菌株的誘導(dǎo)上清，用真空抽干機(jī)濃縮10倍，取10 μl作為樣品，與上樣緩沖液混合均勻，40℃孵育30 min，再60℃孵育10 min，最后煮沸2 min。電泳條件為:恒壓電泳，先40 V 1 h，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，電壓升至60 V約3 h。電泳完畢時(shí)，膠置于染色液中振蕩染色1.5～2.0 h，轉(zhuǎn)至脫色液中擴(kuò)散脫色，直到背景清晰。

1.2.8 重組蛋白質(zhì)抑菌活性測(cè)定 抑菌活性測(cè)定采用管碟法:取處于對(duì)數(shù)生長期的微球菌菌液15 μl稀釋于 150 μl滅菌水中，均勻涂布于 LB 瓊脂板表面，將直徑6 mm的無菌不銹鋼小管放在平板表面，于管內(nèi)滴加樣品100 μl，以同體積的空載體pPIC9K轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)上清為陰性對(duì)照，溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對(duì)照，放置于37℃恒溫箱中，培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體pPIC9K-LYZ的構(gòu)建與鑒定

以重組質(zhì)粒p215C3-LYZ為模板擴(kuò)增出大小約400 bp左右的條帶，瓊脂糖凝膠電泳回收后，用EcoRⅠ及 NotⅠ進(jìn)行酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pPIC9K連接，獲得酵母表達(dá)重組載體pPIC9K-LYZ。Pst I酶切鑒定正確(圖1)，并且DNA測(cè)序證明LYZ基因克隆正確無突變。

圖1 酵母表達(dá)載體pPIC9K-LYZ酶切鑒定Fig.1 Identification of yeast expression vector pPIC9K-LYZ by endonuclease digestion

2.2 重組酵母菌株的篩選與鑒定

將pPIC9K-LYZ轉(zhuǎn)化的酵母菌重組菌在MD平板上培養(yǎng)，挑取單菌落接種于含YPD培養(yǎng)液的96孔板，3次傳代培養(yǎng)使細(xì)胞密度均勻一致，然后用含不同濃度G418的YPD平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，并用MD和MM平板鑒定其甲醇利用型，結(jié)果獲得抗4 mg/ml G418的高拷貝轉(zhuǎn)化子5株，且皆為Muts表型。以高拷貝重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-hLYZ基因組為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1條大小約900 bp的條帶，而以重組畢赤酵母GS115/pPIC9K為模板的PCR產(chǎn)物未擴(kuò)增出目的條帶(圖2)，說明hLYZ基因已經(jīng)整合入GS115基因組中。

圖2 重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-hLYZ的PCR鑒定Fig.2 Identification of recombinant Pichia pastoris GS115/pPIC9K-hLYZ by PCR

2.3 重組蛋白質(zhì)hLYZ在畢赤酵母中的分泌表達(dá)

取0.5%甲醇誘導(dǎo)72 h的Muts型酵母菌表達(dá)上清濃縮10倍，取10 μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，銀染后檢測(cè)到特異表達(dá)條帶，大小約為1.44×104，與理論值相符(圖3)，說明重組蛋白質(zhì)hLYZ在畢赤酵母中成功表達(dá)。

圖3 重組蛋白質(zhì)hLYZ的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein

2.4 重組蛋白質(zhì)hLYZ的抗菌活性

利用管碟法測(cè)定了誘導(dǎo)上清對(duì)溶壁微球菌的抑菌作用，結(jié)果顯示重組蛋白質(zhì)hLYZ及溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)溶壁微球菌均具有良好的抑菌效果，而空載體pPIC9K轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)上清則沒有抑菌作用(圖4)。

圖4 重組蛋白質(zhì)hLYZ抑菌活性測(cè)定Fig.4 Antibacterial assay of the recombinant protein hLYZ

3 討論

隨著人們對(duì)“無毒、無殘留、無耐藥性”新一代抗菌物質(zhì)的認(rèn)識(shí)，溶菌酶已成為研究熱點(diǎn)。溶菌酶廣泛存在于自然界動(dòng)物、植物和微生物中。人們主要從雞蛋清中提取此酶。人溶菌酶(hLYZ)屬于c型溶菌酶，主要用于臨床治療，具有抗菌和抗腫瘤的作用。通常人溶菌酶是從人乳或胎盤中少量提取，由于來源少，提取方法復(fù)雜，不能進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)［5-6］。

隨著基因工程技術(shù)的成熟，通過重組技術(shù)表達(dá)外源蛋白質(zhì)成為可能。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用較為廣泛的第二代真核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白質(zhì)具有基因操作簡單、外源蛋白質(zhì)能正確加工與修飾、表達(dá)量高、易大量發(fā)酵培養(yǎng)、易純化等優(yōu)點(diǎn)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已成功表達(dá)多種外源蛋白質(zhì)［7-11］，有些外源蛋白質(zhì)如人血清白蛋白的表達(dá)量可達(dá)較高水平［12-13］。

本研究采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，成功地分泌表達(dá)了具有抗菌活性的重組蛋白質(zhì)hLYZ，SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果表明表達(dá)的重組蛋白質(zhì)分子量正確，抑菌試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)hLYZ具有良好的殺菌活性，為其大量生產(chǎn)從而開發(fā)新型抗菌藥物奠定了一定的基礎(chǔ)。但有關(guān)hLYZ表達(dá)水平、抗菌效力及作用機(jī)理等還需要進(jìn)一步研究。

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