豬鏈球菌2型體外刺激3D4/21豬肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄分析

汪 偉， 何孔旺， 倪艷秀， 呂立新， 周俊明， 張雪寒， 俞正玉， 茅愛華， 溫立斌，王小敏， 李 彬， 郭容利

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014)

豬鏈球菌(Streptococcus suis)為革蘭氏陽性菌，是豬的一種重要病原體，可引起腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎和肺炎等［1］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)35個血清型(1 ～34型和1/2 型)［2］，最近有報(bào)道將 32、34 兩型重新歸類為鼠口腔鏈球菌(Streptococcus orisratti)［3］。其中豬鏈球菌2型(SS2)是一種重要的人畜共患病病原，人感染SS2主要引起腦膜炎，并伴隨敗血癥、心內(nèi)膜炎和鏈球菌中毒休克綜合征(STSS)［4］，最終導(dǎo)致死亡。在中國江蘇省部分地區(qū)(1998 ～1999 年)［5］及四川省(2005 年)均暴發(fā)過人感染 SS2 至死事件［6］。

目前關(guān)于SS2確切的致病機(jī)制仍不清楚［1］，但已經(jīng)證明某些炎性和傳染性疾病與細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生有關(guān)。特別是一些炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，如 IL－1β［7］、IL－18［8］、IL－8［9］等 促 炎癥細(xì)胞因子。IL－12是這些因子的誘導(dǎo)劑并協(xié)同參與炎癥、介導(dǎo)與臨床疾病的惡化、多器官系統(tǒng)衰竭及休克性死亡相關(guān)的反應(yīng)［10］。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁成份是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要物質(zhì)［11］。盡管單核吞噬細(xì)胞在腦膜炎、敗血癥等致病機(jī)制中起重要作用，但SS2與豬源單核細(xì)胞之間的作用及誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子的研究并不多。

3D4/21 豬肺泡巨噬細(xì)胞是豬肺泡巨噬細(xì)胞的體外傳代細(xì)胞系，在體外已喪失了吞噬功能，但仍保留細(xì)胞因子分泌的功能，其作為研究SS2細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的模型細(xì)胞已有報(bào)道［12］。本試驗(yàn)就SS2不同毒力菌株及impdh缺失株對3D4/21細(xì)胞的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄的影響進(jìn)行研究，旨在為SS2致病機(jī)制提供一個可能的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Todd hweitt bacto(THB)培養(yǎng)基(美國BD公司產(chǎn)品)，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(美國Invitrogen公司產(chǎn)品)，3D4/21豬肺泡巨噬細(xì)胞(美國ATCC產(chǎn)品)，細(xì)胞RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司產(chǎn)品)，AMV反轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司產(chǎn)品)，RNA酶抑制劑(大連TaKaRa公司產(chǎn)品)，Oligo(dT)15(大連TaKaRa公司產(chǎn)品)，SYBR Premix ex Taq(大連TaKaRa公司產(chǎn)品)，Rotor－gene 6000定量PCR儀。

1.2 菌株來源

試驗(yàn)所用的 SS2菌株［ZY05719、ZY05719(△impdh)、HA0609、CS100322－1］均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所人獸共患病防控研究室保存，菌株來源見表1。

表1 試驗(yàn)中所用菌株的生物來源、地理來源及致病性Table 1 Host of origin，geographic origin and pathogenicity of SS2 strains used in this study

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)與處理

用THB平板復(fù)蘇菌株，37℃培養(yǎng) 24～48 h。挑單菌落接種于THB液體培養(yǎng)基，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。取1 ml菌液6 000 g離心6 min，用無菌PBS洗2次。溶于PBS，60℃水浴45 min以滅活細(xì)菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。取滅活后的菌液涂THB平板，37℃培養(yǎng)48 h，以確定是否完全滅活。接種細(xì)胞之前用細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM(10%血清)重懸細(xì)菌至1.0×109CFU/ml。

1.4 3D4/21豬肺泡巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)

3D4/21 豬肺泡巨噬細(xì)胞(以下簡稱3D4/21細(xì)胞)是豬肺泡巨噬細(xì)胞的體外傳代細(xì)胞系，培養(yǎng)于含10%血清的DMEM中，長至單層細(xì)胞。將已長滿單層的細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為2.0×105CFU/ml)培養(yǎng)于24孔細(xì)胞板，每孔1 ml。置 37 ℃、5%CO2下培養(yǎng) 12 h。

1.5 接種

將24孔板上的3D4/21細(xì)胞用DMEM洗2次后，每孔接種 SS2細(xì)菌懸液 100 μl，補(bǔ)加 DMEM(10%血清)900 μl。800 g、25 ℃離心10 min。同時預(yù)留不含SS2細(xì)菌的3D4/21細(xì)胞，作為細(xì)胞因子自然轉(zhuǎn)錄對照組。每個菌株3個重復(fù)。置37℃、5%CO2下分別作用 6 h、12 h 和24 h。

1.6 細(xì)胞RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

在不同接種時間點(diǎn)取出細(xì)胞板，按Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA。以O(shè)ligo(dT)15作為下游引物，應(yīng)用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。20 μl反轉(zhuǎn)錄體系:取 Oligo(dT)15(25 pmol/μl)2.0 μl，加入10.0 μl總 RNA，72 ℃ 10 min，冰浴 5 min 后，加入5 × 反轉(zhuǎn)錄緩沖液 4.0 μl、dNTP(10 mmol/L)2.0 μl、RNA 酶抑制劑(40 U/μl)1.0 μl、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶(10 U/μl)1.0 μl，42 ℃ 反轉(zhuǎn)錄 1 h，95 ℃ 5 min 滅活后置－20℃冰箱備用。

1.7 熒光定量PCR法檢測樣品各細(xì)胞因子的cDNA拷貝數(shù)

用熒光定量 PCR 方法［10，13］檢測各細(xì)胞因子cDNA 拷貝數(shù)。Real－time PCR 20.0 μl反應(yīng)體系:2 ×SYBR Premix ex Taq 10.0 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μl，模板 1.0 μl，ddH2O 8.2 μl。反應(yīng)程序:95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 30～60 s(表2)，40個循環(huán)。每一循環(huán)結(jié)束時讀取熒光信號。總循環(huán)結(jié)束后，加入熔解曲線分析步驟。將各細(xì)胞因子基因的拷貝數(shù)除以同一樣本中β-actin基因的拷貝數(shù)，獲得一個相對比值，以對照組相對比值計(jì)為1，求出刺激組與對照組的倍比值(該值計(jì)為r)，用以表示相應(yīng)細(xì)胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

表2 各細(xì)胞因子和管家基因β-actin熒光定量PCR擴(kuò)增的引物及條件Table 2 Primers and conditions for real-time PCR to amplify cytokines and housekeeping gene β-actin

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

菌株與對照組采用r值比較，r＞2為上調(diào)轉(zhuǎn)錄，r＜0.5為下調(diào)轉(zhuǎn)錄，r＞5時為過度上調(diào)(即過量轉(zhuǎn)錄)。

菌株之間數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用FC(倍數(shù)改變量)表示，F(xiàn)C＞2或FC＜0.5表明倍數(shù)改變有意義。

2 結(jié)果

細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄動力學(xué)結(jié)果顯示，SS2各菌株刺激3D4/21 細(xì)胞后 IL-1β、IL-18、IL-8、IL-12 和 IL-10的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的變化，大小與刺激時間有關(guān)(圖1)。

2.1 SS2病菌對3D4/21細(xì)胞IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

IL－1β是一種重要的促炎癥細(xì)胞因子，在介導(dǎo)細(xì)菌感染后機(jī)體的炎癥反應(yīng)中起重要作用。4株SS2病菌在刺激3D4/21細(xì)胞6 h后均可以誘導(dǎo)IL-1β mRNA上調(diào)轉(zhuǎn)錄(r＞2);12 h均恢復(fù)至穩(wěn)定狀態(tài)(1＜r＜2);24 h后ZY05719仍誘導(dǎo)上調(diào)轉(zhuǎn)錄，HA0609誘導(dǎo)下調(diào)轉(zhuǎn)錄(r＜0.5)，另外2株ZY05719(△impdh)和CS100322－1誘導(dǎo)處于穩(wěn)定狀態(tài)(圖1)。說明強(qiáng)毒株比低毒株和無毒株誘導(dǎo)IL-1β的持續(xù)期更長，可長時間刺激IL-1β的產(chǎn)生，刺激機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

圖1 SS2病菌刺激對3D4/21豬肺泡巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.1 Influence of mRNA level of Streptococcus suis 2 triggered cytokines responses in porcine alveolar macrophages cell lines 3D4/21

2.2 SS2病菌對3D4/21細(xì)胞IL-18 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

IL－18也是一種促炎癥細(xì)胞因子，與IL－1β同屬一個家族。4株SS2病菌在刺激3D4/21細(xì)胞6 h后，ZY05719和 ZY05719(△impdh)均誘導(dǎo) IL-18 mRNA上調(diào)轉(zhuǎn)錄，且 ZY05719誘導(dǎo)過度轉(zhuǎn)錄(r＞5)，轉(zhuǎn)錄水平高于其他菌株(FC＞2)，菌株HA0609和CS100322－1誘導(dǎo)處于穩(wěn)定狀態(tài)。刺激12 h后，除ZY05719(△impdh)誘導(dǎo)IL-18 mRNA上調(diào)轉(zhuǎn)錄，其他菌株誘導(dǎo)均處于穩(wěn)定狀態(tài)。24 h后，ZY05719、ZY05719(△impdh)、HA0609誘導(dǎo)上調(diào)轉(zhuǎn)錄，CS100322－1誘導(dǎo)仍保持穩(wěn)定，但誘導(dǎo)上調(diào)的3株之間沒有差異(1＜FC＜2)。說明強(qiáng)毒株能夠強(qiáng)烈刺激IL-18 mRNA的轉(zhuǎn)錄，impdh缺失株及無毒株HA0609也能夠刺激IL-18 mRNA轉(zhuǎn)錄，但低毒株CS100322－1對IL-18 mRNA的轉(zhuǎn)錄沒有明顯影響。

2.3 SS2病菌對3D4/21細(xì)胞IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

IL－8 與 IL－1β 和 IL－18 一樣，是一種重要的促炎癥細(xì)胞因子。SS2病菌在刺激3D4/21細(xì)胞6 h后，ZY05719(△impdh)誘導(dǎo) IL-8 mRNA上調(diào)轉(zhuǎn)錄，CS100322－1出現(xiàn)一定程度的下調(diào)轉(zhuǎn)錄，而ZY05719與HA0609誘導(dǎo)保持穩(wěn)定狀態(tài)。12 h后，ZY05719明顯誘導(dǎo)上調(diào)轉(zhuǎn)錄(r＞5)，且遠(yuǎn)高于其他菌株(FC＞7);HA0609也誘導(dǎo)上調(diào)轉(zhuǎn)錄，ZY05719(△impdh)和CS100322－1誘導(dǎo)保持穩(wěn)定。24 h后，ZY05719誘導(dǎo)仍保持過度上調(diào)(r＞5)，且高于其他3株(FC＞5)。說明總體上強(qiáng)毒株能夠長時間誘導(dǎo)強(qiáng)烈的IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄，且明顯強(qiáng)于其他3株;ZY05719(△impdh)及無毒株HA0609同樣能夠誘導(dǎo)IL-8 mRNA的轉(zhuǎn)錄，并持續(xù)較長時間;低毒株CS100322－1不能誘導(dǎo)IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄，且有一定程度的抑制。

2.4 SS2病菌對3D4/21細(xì)胞IL-12 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

IL－12 是 IL－1β、IL－18 及 IL－8 等促炎癥細(xì)胞因子的誘導(dǎo)劑并協(xié)同參與炎癥反應(yīng)。在測試的3個時間點(diǎn)內(nèi)，ZY05719(△impdh)與 CS100322－1對 IL-12 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯影響(1＜r＜2)，ZY05719和HA0609表現(xiàn)為誘導(dǎo)IL-12 mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨刺激時間延長呈上升趨勢。24 h后ZY05179誘導(dǎo)明顯上調(diào)(r＞5)，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 impdh缺失株(FC ＞10)，也高于菌株 HA0609和 CS100322－1。說明強(qiáng)毒株更易于誘導(dǎo)IL-12 mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而有利于促炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，這與前面結(jié)果中ZY05719對IL-1β、IL-18和IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于其他菌株一致。

2.5 SS2病菌對3D4/21細(xì)胞IL-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

IL－10屬于抗炎癥細(xì)胞因子，其作用是對抗機(jī)體的炎癥反應(yīng)。在測試的3個時間點(diǎn)內(nèi)，ZY05719誘導(dǎo)IL-10 mRNA一直處于上調(diào)轉(zhuǎn)錄，原因可能是ZY05719誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子過度轉(zhuǎn)錄，引發(fā)了IL-10 mRNA上調(diào)，以維持細(xì)胞自身的穩(wěn)態(tài)，抑制過度炎性因子產(chǎn)生，是細(xì)胞的一種自我保護(hù)反應(yīng)。HA0609誘導(dǎo)總體處于下調(diào)，表明HA0609誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子雖上調(diào)轉(zhuǎn)錄，但未過度轉(zhuǎn)錄，維持低量的IL－10將有利于炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在體內(nèi)有利于適量的炎癥反應(yīng)，以清除細(xì)菌。CS100322－1誘導(dǎo)則處于穩(wěn)定狀態(tài)，表明CS100322－1促炎癥細(xì)胞因子基本沒有大的變化，使得IL－10的變化不明顯，將不利于炎癥反應(yīng)的進(jìn)行和細(xì)菌的清除，細(xì)菌可長時間存活于血液，引發(fā)敗血癥。ZY05719(impdh)誘導(dǎo)與其他3株表現(xiàn)不同，刺激3D4/21細(xì)胞開始時IL-10 mRNA上調(diào)，然后穩(wěn)定，最后下調(diào)。其原因可能是在刺激6 h時IL-1β、IL-18、IL-8的mRNA均上調(diào)轉(zhuǎn)錄，而在12 h和24 h部分因子出現(xiàn)下調(diào)，進(jìn)而影響到IL-10 mRNA的轉(zhuǎn)錄。推測其感染情況:ZY05719(impdh)開始刺激3D4/21細(xì)胞時，產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子與抗炎癥細(xì)胞因子達(dá)到了平衡，動物不發(fā)生過度的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為不發(fā)病;隨著時間的推移，IL－10水平降低，而多種促炎癥細(xì)胞因子仍然產(chǎn)生，引發(fā)持續(xù)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致動物發(fā)病死亡。

3 討論

本研究證明了SS2病菌可以影響3D4/21細(xì)胞IL-1β、IL-18、IL-8、IL-12 及 IL-10 mRNA 的轉(zhuǎn)錄，且這種影響隨刺激時間的長短而變化。這些細(xì)胞因子可能在機(jī)體感染SS2后，在參與或介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中起重要作用。但SS2哪些毒力因子參與刺激細(xì)胞因子及炎癥反應(yīng)仍沒有完全明確。本研究中SS2具有體外刺激免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的能力，這意味著在機(jī)體內(nèi)存在著免疫細(xì)胞對SS2的某些成分產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并由此激發(fā)各種免疫反應(yīng)并產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)與全身性感染。本研究中發(fā)現(xiàn)不同野生SS2菌株的促炎癥細(xì)胞因子及抗炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄與菌株介導(dǎo)的炎癥存在某些內(nèi)在聯(lián)系，對了解SS2體內(nèi)感染也有著積極意義。

許多研究通過無莢膜包裹突變株已清楚地指出細(xì)菌細(xì)胞壁成分是主要的細(xì)胞因子誘導(dǎo)物，但其機(jī)制仍不清楚。例如CPS能夠以不依賴MyD88方式特異性誘導(dǎo)產(chǎn)生 MCP－1［14］。Segura 等［15］人采用小鼠巨噬細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)SS2與細(xì)胞共刺激后可產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子IL－6和TNF－α，且對細(xì)菌濃度和時間有依賴性，并發(fā)現(xiàn)SS2純化的EF和SLY致病因子不能刺激細(xì)胞因子的釋放。Dominguez－Punaro等［16］在老鼠體內(nèi)感染SS2 24 h后觀察到高水平的全身性細(xì)胞因子 TNF－α、IL－6、IL－12、IFN－γ 及趨化因子 CCL2/MCP－1、CXCL1/KC 和 CCL5/RANTE，認(rèn)為這是動物早期突然死亡的原因。Vanier等［17］認(rèn)為SS能夠誘導(dǎo)炎性介導(dǎo)加劇釋放而導(dǎo)致白細(xì)胞大量積聚并釋放炎性介質(zhì);但是SS可調(diào)控這種反應(yīng)，通過積極降低趨化因子和延緩嗜中性粒細(xì)胞積聚至炎癥部位，以提高其存活能力。

豬鏈球菌2型無論是體內(nèi)還是體外刺激炎癥相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生，都是一個復(fù)雜的、受多種因素影響的過程。尋找一個適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)?zāi)Ｐ秃脱芯糠椒?，對了解該菌體內(nèi)和體外感染機(jī)制是十分重要的。多國學(xué)者試圖通過研究體內(nèi)或體外相關(guān)細(xì)胞因子(主要炎癥相關(guān)細(xì)胞因子)的變化，來進(jìn)一步了解SS2的致病機(jī)制。但目前對SS2真正的致病機(jī)制仍未有一個明確的定論，需要繼續(xù)研究，以便對該病原菌的預(yù)防和治療提供有效的策略。

［1］AL－NUMANI D，SEGURA M，DORé M，et al.Up－regulation of ICAM－1，CD11a/CD18 and CD11c/CD18 on human THP－1 monocytes stimulated by Streptococcus suis serotype 2［J］.Clin Exp Immunol，2003，133:67－77.

［2］LI J，XIA J，TAN C，et al.Evaluation of the immunogenicity and the protective efficacy of a novel identified immunogenic protein，SsPepO，of Streptococcus suis serotype 2［J］.Vaccine，2011，29:6514.

［3］HILL J E，GOTTSCHALK M，BROUSSEAU R，et al.Biochemical analysis，cpn60 and 16S rDNA sequence data indicate that Streptococcus suis serotypes 32 and 34，isolated from pigs，are Streptococcus orisratti［J］.Veterinary Microbiology，2005，107:63－69.

［4］FENG Y，ZHANG H，MA Y，et al.Uncovering newly emerging variant of Streptococcus suis，an important zoonotic agent［J］.Cell，2010，18:124－125.

［5］羅 玲，艾地云，楊 峻，等.豬鏈球菌2型病的研究現(xiàn)狀及防治措施［J］. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，12(7):70.

［6］WERTHEIM H F，NGHIA H D，TAYLOR W，et al.Streptococcus suis:An emerging human pathogen［J］.Clinical Infectious Diseases，2009，48:617－625.

［7］DINARELLO C A.The IL－1 family and inflammatory diseases［J］.Clinical and Experimental Rheumatology，2002 ，20(Suppl):1－13.

［8］DINARELLO C A，NOVICK D，PUREN A J，et al.Overview of interleukin－18:more than an interferon－γ inducing factor［J］.Journal of Leukocyte Biology，1998，63:658－664.

［9］TIZARD I R.Veterinary immunology:an introduction［M］.8th ed.St.Louis，MO:Elsevier Saunders ，2009:309.

［10］汪 偉，倪艷秀，溫立斌，等.豬IL－1β 與IL－18 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法的建立［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27(6):1289－1294.

［11］SEGURA M，VANIER G，AL－NUMANI D，et al.Proinflammatory cytokine and chemokine modulation by Streptococcus suis in a whole－blood culture system［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2006，47:92－106.

［12］DE GREEFF A，BENGA L，WICHGERS SCHREUR P J，et al.Involvement of NF－kB and MAP－kinases in the transcriptional response of alveolar macrophages to Streptococcus suis［J］.Veterinary Microbiology，2010，141:59－67.

［13］汪 偉.豬鏈球菌2型對細(xì)胞的粘附作用和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的影響［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［14］SEGURA M，VANIER G，AL－NUMANI D，et al.Proinflammatory cytokine and chemokine modulation by Streptococcus suis in a whole－blood culture system［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2006，47(1):92－106.

［15］SEGURA M，STANKOVA J，GOTTSCHALK M.Heat－killed Streptococcus suis capsular type 2 strains stimulate tumor necrosis factor alpha and interleukin－6 production by murine macrophages［J］.Infection and Immunity，1999，67(9):4646－4654.

［16］DOMíNGUEZ－PUNARO M C，SEGURA M，PLANTE M M，et al.Streptococcus suis serotype 2，an important swine and human pathogen，induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection［J］.J Immunol，2007，179(3):1842－1854.

［17］VANIER G，SEGURA M，LECOURS M P，et al.Porcine brain microvascular endothelial cell－derived interleukin－8 is first induced and then degraded by Streptococcus suis［J］.Microb Pathog，2009，46(3):135－143.