姜黃素對肝星狀細胞JAK2－STAT3信號通路的影響＊

鄭旭銳 樊英華 韋永紅 宋 健 曹 寧 王禮鳳 應小平 惠 毅

陜西中醫(yī)學院（咸陽712046）

姜黃素（Curcumin，Cur）是從中藥姜黃中提取的一種酚類色素，其具有抗腫瘤、抗氧化、保肝等廣泛的藥理作用，本實驗觀察姜黃素對肝星狀細胞（HSC－T6）JAK2－STAT3信號通路轉導的影響。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料 ①重組瘦素蛋白（為美國Protech公司生產(chǎn)）；②actin及化學發(fā)光試劑（購自北京中山公司）；③RPMI－1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司生產(chǎn)）；④山羊抗兔二抗、JAK2、STAT3（均為北京博奧森生物技術有限公司生產(chǎn)）；⑤10%胎牛血清（杭州四季青生物制品有限公司生產(chǎn)）；⑥HSC－T6（購自上?？蠌妰x器有限公司）。

1.2 實驗方法 1.2.1 細胞培養(yǎng)方法：培養(yǎng)基：RPMI－1640＋10%胎牛血清。培養(yǎng)液：37.0C carbon dioxide（CO2），5%。①棄去培養(yǎng)液，用PBS（不含鈣，鎂離子）洗1～2次；②加1mL消化液（0.25%Trypsin－0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，倒轉放于37度培養(yǎng)箱1～3min預熱，然后又將培養(yǎng)瓶倒轉大約30s后，在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓分散，輕敲幾下培養(yǎng)培養(yǎng)瓶，細胞隨即脫落下來；③加入6～8mL完全培養(yǎng)基，吸出，分到新的培養(yǎng)瓶中。每2d傳代1次。

1.2.2 制備藥物血清：姜黃素（購自Sigma公司）；秋水仙堿：西雙版納制藥廠生產(chǎn)（批號：C－2284）。Wistar大鼠36 只，雄性，體重180g±20g，清潔級，均購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心。

將動物按隨機數(shù)字表法隨機分為3組：正常（A）組、姜黃素（B）組、秋水仙堿（C）組，每組均12只大鼠。①A 組給予相應劑量生理鹽水灌胃；②其余2組每日均按1mL／100g藥液經(jīng)胃灌藥1次。以上各組大鼠均采用連續(xù)灌胃7d的方法。

1.2.3 取材方法：①將各實驗組大鼠禁食不禁水12h，在最后一次灌藥1h后，每只大鼠（按0.35mL／100g的劑量）用含10%水合氯醛進行麻醉；②麻醉成功后每組動物進行心臟采血（2mL／只）；③用3000r／分的離心機離心分離血清；④在56℃水浴中滅活30min；⑤用0.44um 微孔濾膜過濾后冷藏－20℃冰箱中以備后用。

1.2.4 蛋白印跡試驗：按試劑盒說明書操作。

2 結 果

2.1 姜黃素組含藥血清對肝星狀細胞JAK2蛋白表達影響 與正常組比較，姜黃素組6h、12、24h時間段的蛋白條帶顏色均變淺，而且在12h的蛋白條帶顏色最淺。見圖1。

圖1 1～4分別表示姜黃素組0，6，12，24h的蛋白條帶顏色

2.2 作用6h后，各組含藥血清對增殖后的肝星狀細胞中JAK2蛋白表達影響 與正常組比較，姜黃素組、秋水仙堿組蛋白條帶顏色均變淺，而姜黃素組蛋白條帶顏色與秋水仙堿組比較則未見明顯差異（圖2）。

圖2 姜黃素對增殖后的肝星狀細胞的JAK2表達的影響結果

2.3 姜黃素對肝星狀細胞STAT3蛋白表達影響 與正常血清組比較，姜黃素藥物血清作用6h后，蛋白條帶顏色開始逐漸變淺，STAT3表達水平逐漸降低，至24h顏色最淺，表明STAT3蛋白表達水平達到最低（圖3）。

圖3 1～4分別表示姜黃素0，6，12，24h的蛋白條帶顏色

2.4 作用12h后，各組含藥血清對增殖后的肝星狀細胞中STAT3蛋白表達影響 與正常組比較，姜黃素組、秋水仙堿組蛋白條帶顏色變淺，而姜黃素組與秋水仙堿組比較則無明顯差異（圖4）。

圖4 姜黃素對增殖后的肝星狀細胞STAT3表達的影響結果

3 討 論

肝星狀細胞（HSC）的激活是導致肝纖維化的一個共同的途徑，其共有的表現(xiàn)是HSC轉化為肌成纖維細胞，合成大量的細胞外基質(zhì)（ECM），ECM 在肝臟內(nèi)大量的沉積，最終導致肝纖維化的形成，故現(xiàn)代醫(yī)學認為肝纖維化發(fā)生的細胞學基礎是HSC的活化與增殖［1］。人HSC 活化增殖時Ⅰ型膠原mRNA為靜止時的60～70倍［2］，HSC活化增殖，膠原合成增加是肝纖維化形成的直接原因。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)瘦素是促肝纖維化細胞因子，它是肥胖基因編碼的一種肽類激素，其具有顯著誘導HSC 活化和增殖的作用［3］。現(xiàn)有研究表明，HSC 內(nèi)瘦素受體后信號轉導途徑主要涉及到JAR－STAT（Janos激酶結合結構域與信號轉導和轉錄激活因子）途徑，JAR－STAT 途徑僅由JARs和STATs兩級信號傳遞組分構成，當瘦素與其受體結合后，激活JAK 激酶，JAK 酪氨酸磷酸化后與磷酸化受體進一步結合，從而使下游胞漿蛋白STAT 磷酸化，STAT 磷酸化后轉入核內(nèi)，識別并結合到啟動因子區(qū)瘦素的活化序列或相關序列，調(diào)控瘦素的基因轉錄［4，5］。

姜黃素（curcumin，cur）是從中藥姜黃根莖中提取的一種天然有效成分，其具有抗氧化、抗病毒、保肝等廣泛的藥理作用［6］。我們對于姜黃素的前期研究已經(jīng)做了姜黃素對于肝纖維化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ－C含量及肝組織TGFβ1的影響的研究以及姜黃素治療慢性乙型肝炎肝纖維化臨床療效觀察，證明其有較好的抗肝纖維化的作用［7－10］。

本次研究結果顯示：姜黃素能降低肝星狀細胞中JAK2、STAT3蛋白的表達，阻斷JAK2－STAT3信號轉導，說明姜黃素可能是通過降低JAK2、STAT3 蛋白表達，阻斷JAK2－STAT3信號轉導來實現(xiàn)其抗肝纖維化作用的。

［1］ 董培紅，何生松，蘇 剛，等.內(nèi)毒素對大鼠肝星狀細胞活化和瘦素表達的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2006，15（2）：156－158.

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［9］ 鄭旭銳，孫守才，李長秦，等.姜黃素對肝纖維化大鼠肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA 影響的研究［J］.中藥材，2007，30（9）：1118－1119.

［10］ 鄭旭銳，張選國，宋 健，等.姜黃素對肝纖維化模型肝組織Ⅳ型膠原和轉化生長因子β1mRNA 表達的影響［J］.陜西中醫(yī)，2009，30（6）：749－750.