紅小豆生物技術(shù)研究進(jìn)展

高義平 董福雙 王海波

（1. 河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳研究所 植物轉(zhuǎn)基因中心，石家莊 050051；2. 保定市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，保定 071000）

紅小豆是豆科（Leguminosae）、豇豆屬（Vigna）中的一個(gè)栽培種（V.angularis），其籽粒高蛋白、中淀粉、低脂肪，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有食藥兼用的價(jià)值，隨著人們消費(fèi)水平的提高，越來(lái)越受到消費(fèi)者青睞。早期研究認(rèn)為紅小豆起源于中國(guó)。我國(guó)紅小豆種植歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，年種植面積和總產(chǎn)量一直位居世界首位。關(guān)于紅小豆生物技術(shù)的研究和應(yīng)用，日本起步較早，我國(guó)的研究和應(yīng)用起步晚，基礎(chǔ)薄弱，大部分工作還集中在種質(zhì)資源的分子標(biāo)記鑒定方面，研究的深度和廣度都有待加強(qiáng)。本文是從分子水平和細(xì)胞水平上對(duì)紅小豆生物技術(shù)方面的最新研究、應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，以給紅小豆遺傳、育種工作者提供參考。

1 紅小豆DNA水平的研究

紅小豆DNA水平上的研究主要集中在利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)紅小豆的起源、傳播、進(jìn)化、種質(zhì)資源的遺傳多樣性、不同地域栽培型、半野生型、野生型小豆的變異程度及其相互之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近等方面的研究，遺傳圖譜構(gòu)建、基因克隆與轉(zhuǎn)化等工作相對(duì)較少。

1.1 種質(zhì)資源鑒評(píng)和起源的研究

應(yīng)用分子標(biāo)記對(duì)小豆種植資源鑒定評(píng)價(jià)和起源的研究最早始于1993年，Kaga等［1]應(yīng)用RAPD標(biāo)記將一個(gè)豇豆品種與12個(gè)小豆栽培品種區(qū)分開(kāi)，后來(lái)Yee等［2]用RAPD和AFLP標(biāo)記對(duì)來(lái)自中國(guó)、日本、韓國(guó)的58個(gè)品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)小豆種間遺傳多樣性豐富，可以保證小豆種內(nèi)遺傳圖譜群體的成功構(gòu)建。之后國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者相繼開(kāi)展了分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于小豆遺傳、育種的基礎(chǔ)性研究，尤其是種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究。

1.1.1 關(guān)于小豆起源的研究 瓦維洛夫在《主要作物的世界起源中心》一書(shū)中，將中國(guó)的中部和西部山區(qū)及其比鄰的洼地列為小豆的起源中心。隨著分子技術(shù)的興起，利用分子標(biāo)記手段尋求小豆起源、進(jìn)化的證據(jù)成為早期起源研究的課題之一。葉劍等［3]利用SSR引物對(duì)來(lái)自中國(guó)、日本、韓國(guó)、不丹、越南5國(guó)的104份栽培小豆種質(zhì)資源的研究表明，中國(guó)西南地區(qū)的栽培小豆種質(zhì)存在較豐富的遺傳多樣性，初步認(rèn)為我國(guó)西南地區(qū)可能是小豆的一個(gè)起源中心和遺傳多樣性中心。宗緒曉等［4]用12對(duì)AFLP引物對(duì)來(lái)自6個(gè)國(guó)家的146份小豆栽培型和野生型種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果認(rèn)為中國(guó)、日本群島、喜馬拉雅山西側(cè)地區(qū)，應(yīng)均為紅小豆的起源中心，初步肯定了栽培小豆的多起源中心觀(guān)點(diǎn)，向中國(guó)唯一起源中心說(shuō)提出質(zhì)疑。

1.1.2 關(guān)于小豆進(jìn)化的研究 關(guān)于栽培小豆的進(jìn)化來(lái)源目前還沒(méi)有定論。Xu等［5]、金文林等［6]利用RAPD標(biāo)記研究顯示，遺傳變異程度由高到低依次為野生小豆、半野生小豆和栽培小豆，小豆的進(jìn)化是由野生到半野生到栽培型的過(guò)程，然而也有研究認(rèn)為栽培小豆來(lái)源于野生小豆，除了二者染色體數(shù)目相同、雜交可行外，Xu等［7]、Mimura等［8]進(jìn)一步用分子標(biāo)記研究遺傳多樣性的結(jié)果也支持了這一觀(guān)點(diǎn)。關(guān)于半野生小豆的來(lái)源Yamaguchi提出了3種假設(shè)，一是野生種和栽培種之間的進(jìn)化產(chǎn)物；二是古老栽培種的退化種；三是栽培種與野生種的雜交衍生物［9]。研究結(jié)果的差異可能因研究材料的不同而引起［10]。

1.1.3 關(guān)于遺傳多樣性的研究 宗緒曉等［4]、粟生群等［11]、佘躍輝等［12]分別利用不同的分子標(biāo)記對(duì)我國(guó)栽培型小豆種質(zhì)資源遺傳多性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均證明：我國(guó)小豆栽培型種質(zhì)間存在較豐富的遺傳多樣性；RAPD、AFLP、RAMP等分子標(biāo)記均可檢測(cè)到較高的多態(tài)性，可以作為小豆遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定和分類(lèi)以及新品種保護(hù)的有效工具。

1.2 遺傳圖譜構(gòu)建

小豆的第一張分子標(biāo)記遺傳圖譜是1996年由Kaga等［13]利用兩個(gè)栽培品種的F2家系建立的。2000年，Kaga等［14]用栽培品種和飯豆品種的F2家系建立了一個(gè)相對(duì)完善的遺傳圖譜。2005年，Han等［15]以日本地方品種與尼泊爾野生種的BC1F1群體為作圖群體，構(gòu)建了一張中等飽和度的小豆遺傳連鎖圖，這也是迄今為止飽和度最高的小豆連鎖圖譜。Isemura等［16]和Kaga等［17]再次分別建立了兩個(gè)遺傳圖譜，并標(biāo)記了多個(gè)數(shù)量性狀基因（表1）。

Chaitieng等［18]比較了小豆和豇豆的連鎖圖譜，研究表明小豆和豇豆分子標(biāo)記排列順序高度保守，但在進(jìn)化過(guò)程中兩個(gè)種之間基因組發(fā)生了倒位、插入、缺失、重復(fù)和易位現(xiàn)象，第1、2、5連鎖群發(fā)生倒位，小豆第1連鎖群與豇豆第10連鎖群部分區(qū)域一致，兩個(gè)物種的SSR等分子標(biāo)記可以通用。

表1 紅小豆遺傳圖譜的構(gòu)建情況

1.3 基因克隆

小豆基因克隆工作多以其他作物相關(guān)基因序列來(lái)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行。Zheng等［19]根據(jù)其他作物ABA-Gpase設(shè)計(jì)兼并引物，從cDNA文庫(kù)克隆，與誘導(dǎo)ABA-Gpase進(jìn)行Northernblot雜交，從小豆的幼苗中克隆并鑒定了一個(gè)ABA-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因。劉燕等［20]根據(jù)大豆、豌豆等植物的鐵蛋白基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用RACE延伸技術(shù)獲得紅小豆鐵蛋白基因的cDNA 全長(zhǎng)序列，將攜帶該基因的表達(dá)載體通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入水稻。對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻葉片的PCR檢測(cè)和鐵含量測(cè)定證明，目的片段已經(jīng)整合到水稻基因組中。陳新等［21]根據(jù)豇豆PR基因、四季豆PvPR1、PvPR2基因及綠豆PR10基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以小豆cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆到了PR類(lèi)抗病基因VaPR3。Kouichi 等［22]通過(guò)對(duì)小豆下胚軸在不同處理時(shí)間300 G超重力時(shí)VaKTN1（劍蛋白基因）轉(zhuǎn)錄水平的研究顯示，15 min內(nèi)VaKTN1轉(zhuǎn)錄水平增加，45 min時(shí)轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最大值，2 h時(shí)這一水平降至正常水平范圍。

1.4 遺傳轉(zhuǎn)化研究

小豆的遺傳轉(zhuǎn)化工作多圍繞小豆籽粒的抗豆象工作展開(kāi)。Yamada等［23]以pSG65T為基因載體、根癌農(nóng)桿菌EHA105為侵染菌株、卡那霉素為抗性篩選基因、gfp為報(bào)告基因，研究了小豆的上胚軸的轉(zhuǎn)化效率，得到了2%的轉(zhuǎn)化率。Chen等［24]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把綠豆品種（Vc6089A）抗豆象基因VrD1轉(zhuǎn)入到當(dāng)?shù)卦耘嘈《怪?，得到了成功表達(dá)；Matusim等［25]通過(guò)pZHBG質(zhì)粒攜帶、農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小豆上胚軸，將抗豆象基因轉(zhuǎn)化到日本北海道栽培小豆品種中，經(jīng)Southern雜交檢測(cè)到了31個(gè)轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化率14%；Nishizawa等［26]將來(lái)源于普通菜豆的α-淀粉酶抑制劑2（αAI-2）基因，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入小豆，Southern雜交結(jié)果顯示獲得了3個(gè)整合方式不同的穩(wěn)定品系。免疫印跡分析顯示，αAI-2基因在轉(zhuǎn)基因小豆種子中得到了表達(dá)。轉(zhuǎn)基因小豆與普通菜豆具有相同的α-淀粉酶的抑制特異性。通過(guò)小豆象鼻蟲(chóng)侵害試驗(yàn)，3個(gè)轉(zhuǎn)基因小豆品系具有了極高的抗性水平。

2 紅小豆細(xì)胞水平的研究

2.1 組織培養(yǎng)、胚拯救及原生質(zhì)體培養(yǎng)

20世紀(jì)80年代是紅小豆組織培養(yǎng)研究的密集期。魯明塾等［27]通過(guò)MS+1.0 mg/L ZT+500 mg/L LH誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基、MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+ 500 mg/L LH誘導(dǎo)愈傷分化成苗培養(yǎng)基、MS+500 mg/L LH誘導(dǎo)幼苗生根培養(yǎng)基將小豆子葉外植體通過(guò)愈傷途徑再生成苗；許智宏［28]將小豆上胚軸在添加生長(zhǎng)素的MS培養(yǎng)基上直接再生成苗；Ozaki［29]將MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的致密型愈傷在MS+0.2或1.0 mg/L BA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)成苗；金文林［30]用小豆幼根、上胚軸、初生葉、子葉等幾種外植體都誘導(dǎo)出了良好的愈傷組織，上胚軸在MS+6-BA培養(yǎng)基上不通過(guò)愈傷途徑直接再生成苗。

胡英考［31]開(kāi)展了小豆與飯豆的雜種幼胚胚拯救研究，其中以小豆為母本的11 d以上的幼胚，在MS和MB（MS無(wú)機(jī)+B5有機(jī)）基本培養(yǎng)基、添加1.0 mg/L IAA和0.2 mg/L KT的兩種培養(yǎng)基上，獲得了13個(gè)植株，但幼苗移栽后死亡，沒(méi)有得到開(kāi)花結(jié)實(shí)植株。

小豆原生質(zhì)體再生植株成功的報(bào)道有兩例。黃培銘和葛扣鱗［32]將葉肉原生質(zhì)體愈傷組織分化成苗；Sato等［33]用北海道小豆栽培品種誘導(dǎo)原生質(zhì)體，再通過(guò)原生質(zhì)體培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗，并獲得了再生苗的種子。所用的培養(yǎng)基有：MS+2.0 mg 2，4-D固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)上胚軸愈傷；同樣培養(yǎng)基的液體誘導(dǎo)懸浮細(xì)胞系；1%纖維素酶+0.1%果膠酶+1.5%溶解酶+0.4 mol/L甘露糖醇的CPM鹽溶液（即將纖維素酶、果膠酶、溶解酶、甘露糖醇全部溶解于CPM鹽溶液）破壁獲得原生質(zhì)體；原生質(zhì)體在MS+1.0 mg /L 2，4-D+1.0 mg/L BAP固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)、在MS+1.0 mg/L BAP +0.1 mg/L IAA上誘導(dǎo)出芽成功。

2.2 染色體核型分析

小豆染色體在豇豆屬中相對(duì)較小，不易觀(guān)察，細(xì)胞遺傳學(xué)的研究報(bào)道較少。郭淑華等［34]選用4個(gè)北京地方小豆種質(zhì)進(jìn)行了染色體核型分析，確定其染色體數(shù)目2n=22，染色體核型為2n=14M+6SM+2Sat，但參試材料間染色體組型無(wú)明顯差異。金文林等［35]用60Co-γ射線(xiàn)處理小豆風(fēng)干種子后，對(duì)小豆根尖染色體畸變率進(jìn)行了觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)γ射線(xiàn)照射造成小豆根尖染色體橋和斷片頻率較高。

佘躍輝［36]于2005年應(yīng)用改良ASG法對(duì)12個(gè)小豆種質(zhì)染色體的核型進(jìn)行了比較分析，并對(duì)3個(gè)小豆種質(zhì)染色體進(jìn)行了G-帶帶型的初步觀(guān)察，結(jié)果表明，12份小豆種質(zhì)在染色體形態(tài)特征上存在差異，其核型組成上有6種類(lèi)型，分別為：2n=22=20m+2sm，2n=22=18m+4sm，2n=22=16m+6sm，2n=22=16m+6sm（2Sat），2n=22=14m+8sm，2n=22=14m+8sm（2Sat），核型類(lèi)型上分為1A和2A兩種類(lèi)型。G-帶帶型分析表明，同源染色體的帶紋數(shù)目、分布位置、染色深淺基本一致，可以較準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體配對(duì)；非同源染色體的帶型有明顯差異，可以準(zhǔn)確區(qū)分。不同種質(zhì)間在G-帶帶型上存在多態(tài)性，反映了小豆各種質(zhì)之間在遺傳結(jié)構(gòu)上的差異，揭示出小豆種在染色體結(jié)構(gòu)上存在著多樣性。

3 小結(jié)

在細(xì)胞水平上，首先，雖然前人有過(guò)成功的愈傷組織、原生質(zhì)體再生成苗經(jīng)驗(yàn)［27，33]，但目前國(guó)際上仍沒(méi)有一種快速獲得組培苗材料的方法，愈傷組織再生成苗、原生質(zhì)體再生成苗等技術(shù)還不成熟。把一個(gè)品種通過(guò)組培途徑再生成苗需要幾個(gè)月甚至1-2年的摸索，而且遇到難培養(yǎng)類(lèi)型還往往不能成功。這使得小豆的轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用受到很大限制；其次，遠(yuǎn)緣雜交雖可為育種創(chuàng)造巨大的增產(chǎn)及抗病潛力，但胚拯救、原生質(zhì)體融合等技術(shù)在小豆上仍是一道難關(guān)，這使得遠(yuǎn)緣雜交在育種上的應(yīng)用也受到很大限制。

在分子水平上，還沒(méi)有足夠多的引物用于品種鑒定、基因克隆和分子標(biāo)記輔助育種。目前應(yīng)用于小豆研究的分子標(biāo)記主要是RAPD和AFLP，而有關(guān)小豆SSR標(biāo)記目前報(bào)道的只有幾十對(duì)引物［37，38]。

小豆生物技術(shù)研究有很多工作，但急需的是以應(yīng)用基礎(chǔ)研究為主，加強(qiáng)細(xì)胞水平、分子水平的研究，即建立遠(yuǎn)緣雜交的支撐技術(shù)體系，建立細(xì)胞培養(yǎng)的再生技術(shù)體系；開(kāi)發(fā)育種需求高的與抗性、適應(yīng)性、品質(zhì)等性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記；標(biāo)記控制小豆重要農(nóng)藝性狀的基因；構(gòu)建高密度的小豆分子連鎖圖譜，從而通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交、遺傳轉(zhuǎn)化和MAS等手段使小豆的育種和遺傳學(xué)研究能上一個(gè)新臺(tái)階。另外，從事小豆基礎(chǔ)研究和育種的機(jī)構(gòu)和人員相對(duì)較少，因此開(kāi)展國(guó)際交流與合作十分必要。若此，將會(huì)對(duì)小豆的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究以及在世界上更大范圍生產(chǎn)起到很大作用。

［1] Kaga A, Hosaka K, Kimura T, et al. Application of random amplified polymorphic DNA（RAPD）analysis for adzuki bean and its related genera［R] . Science Reports of Faculty of Agriculture, Kobe University, 1993, 20（2）：171-176.

［2] Yee E, Kidwell KK, Sills GR, et al. Diversity among selected vigna angularis（Azuki）accessions on the basis of RAPD and AFLP markers［J] . Crop Science, 1999, 39（1）：268-275.

［3] 葉劍, 趙波, 佟星, 等. 栽培小豆種質(zhì)資源遺傳多樣性SSR標(biāo)記分析［J] . 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2008, 23（1）：8-13.

［4] 宗緒曉, Vaughan D, Tomooka N, 等. AFLP 初析小豆栽培和野生變種（Vigna angularis and var. nipponensis）間演化與地理分布關(guān)系［J] . 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 36（4）：367-374.

［5] Xu RQ, Tomooka N, Vaughan DA, et al. TheVigna angulariscomplex：Genetic variation and relationships revealed by RAPD analysis,and their implications forin situconservation and domestication［ J ] .Genet Resour Crop Evol, 2000, 47：123-134.

［6] 金文林, 文自翔, 濮紹京, 等. 應(yīng)用RAPD 標(biāo)記檢測(cè)小豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性初探［J] . 作物學(xué)報(bào), 2004, 30（6）：590-595.

［7] Xu RQ, Tomooka N, Vaughan DA, et al. Plant genetic resources：AFLP markers for characterizing the adzuki bean complex ［J] .Crop Science, 2000, 40（3）：808- 815.

［8] Mimura M, Yasuda K, Yamaguchi H. RAPD variation in wild, weedy and cultivated azuki beans in Asia ［J] .Genetic Resources and Crop Evolution, 2000, 47：603-610.

［9] Yamaguchi H. Wild and weed azuki beans in Japan ［ J ] . Econ Bot,1992, 46（4）：384-394.

［10] Yoon MS, Lee J, Kim CY, et al. Genetic relationships among cultivated and WildVigna angularis（Willd.）Ohwi et ohashiand relatives from Korea based on AFLP markers［J] . Genetic Resources and Crop Evolution, 2007, 54（4）：875-883.

［11] 粟生群, 榮廷昭, 佘躍輝, 等. 利用 AFLP 標(biāo)記鑒定小豆栽培型種質(zhì)遺傳多樣性［J] . 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 23（2）：156-162.

［12] 佘躍輝, 榮廷昭, 粟生群, 等. 應(yīng)用RAMP分子標(biāo)記分析小豆栽培型種質(zhì)資源遺傳多樣性［J] . 作物學(xué)報(bào), 2006, 32（2）：217-222.

［13] Kaga A, Ohnishi M, Ishii T, et al. A genetic linkage map of azuki bean constructed with molecular and morphological markers using an interspecific population（Vigna angularis V. nakashimae）［J] .Theoretical and Applied Genetics, 1996, 93（5）：658- 663.

［14] Kaga A, Ishii T, Tsukimoto K, et al. Comparative molecular mappinginCeratotropisspecies using an interspecific cross between azuki bean（Vigna angularis）and rice bean（V. umbellata）［J] .Theoretical and Applied Genetics, 2000, 100（2）：207-213.

［15] Han OK, Kaga A, Isemura T, et al. A Genetic linkage map for azuki bean（Vigna angularis（Willd.）Ohwi & Ohashi）［J] . Theoretical and Applied Genetics, 2005, 111（7）：1278-1287.

［16] Isemura T, Kaga A, Konishi S, et al. Genome dissection of traits related to domestication in azuki bean（Vigna angularis）and comparison with other warm season legumes ［J] . Annals of Botany,2007, 100（5）：1053-1071.

［17] Kaga A, Isemura T, Tomooka N, et al. The genetics of domestication of the azuki bean（Vigna angularis）［J] . Genetics, 2008, 178（2）：1013-1036.

［18] Chaitieng B, Kaga A, Tomooka N, et al. Development of a black gram（Vigna mungo（L.）hepper）linkage map and its comparison with an azuki bean（Vigna angularis（Willd.）Ohwi and Ohashi）linkage map. ［J] Theor Appl Genet, 2006, 113（7）：1261-1269.

［19] Zheng JX, Masatoshi N, Yoshihito S, et al. Cloning and characterization of the abscisic acid-specific glucosyltransferase gene from adzuki bean seedlings［J] . Plant Physiology, 2002, 129（3）：1285-1295.

［20] 劉燕. 紅小豆鐵蛋白基因的克隆及在水稻中的轉(zhuǎn)化［D] . 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

［21] 陳新, 陳華濤, 袁星星, 等. 小豆抗病相關(guān)基因 VaPR3 的克隆與表達(dá)分析［J] . 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 25（5）：1068 -1073.

［22] Soga K, Kotake T, Wakabayashi K, et al. The transcript level of katanin gene is increased transiently in response to changes in gravitational conditions in azuki bean epicotyls ［J] . Biological Sciences in Space, 2009, 23（1）：23-28.

［23] Yamada T, Teraishi M, Hattori K, et al. Transformation of azuki bean byAgrobacterium tumefaciens［J] . Plant Cell Tissue Organ Cult, 2001, 64（1）：47-54.

［24] Chen GH, Hsu MP, Tan CH, et al. Cloning and characterization of a plant defense VrD1 from azuki bean［J] . Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53（4）：982-988.

［25] Khalafalla MM, El-Shemy HA, Mizanur RS, et al. Recovery of herbicide-resistant azuki bean（Vigna angularis（Wild.）, Ohwi& Ohashi）plants viaAgrobacterium-mediated transformation ［J] .African Journal of Biotechnology, 2005, 4（1）：61-67

［26] Nishizawa K, Teraishi M, Utsumi S, et al. Assessment of the importance of α-amylase inhibitor in bruchid resistance of wild common bean［J] . Theoretical and Applied Genetics, 2007, 114（4）：56-62.

［27] 魯明塾, 葛扣鱗, 楊金水. 赤豆子葉愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生［J] . 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1985（4）：35-38.

［28] 許智宏, 楊麗君, 衛(wèi)志明, 等. 四種豆科植物組織培養(yǎng)中植株再生［J] . 實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào), 1984（4）：483-486.

［29] Ozaki K. Plant regeneration from epicotyl culture of azuki bean（Vigna angularisOhwi & Ohashi）. 植物組織培養(yǎng), 1985, 2（2）：59-62

［30] 金文林, 蓬原雄三. 小豆外植體的愈傷組織誘導(dǎo)及直接植物體再分化［J] . 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 1993, 8（1）：95-99.

［31] 胡英考. 小豆的種子蛋白變異給予飯豆可雜交性研究［D] .北京：中國(guó)農(nóng)科院研究生院, 1995：27-29.

［32] 黃培銘, 葛扣鱗. 赤豆葉肉原生質(zhì)體愈傷組織再生植株［J] .上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1989（1）：31-36.

［33] Sato T, Asaka D, Harada T, et al. Plant regeneration from protoplasts of azuki bean［J] . Japanese Journal of Breeding. 1993, 43（2）：183-190.

［34] 郭淑華, 金文林. 小豆（Vigna angularis）染色體組型分析的研究［J] . 北京農(nóng)業(yè)科學(xué), 1988（2）：19-22.

［35] 金文林, 呂志軍, 金弘, 等.60Co-γ射線(xiàn)不同劑量處理小豆種子的細(xì)胞遺傳學(xué)效應(yīng)［J] .北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 1996, 11（1）：28-33.

［36] 佘躍輝. 小豆種質(zhì)資源研究［D] . 四川：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

［37] Wang XW, Kaga A, Tomooka N, et al. The development of SSR mar-kers by a new method in plants and their application to gene flow studies in azuki bean ［Vigna angularis（Willd.）Ohwi &Ohashi] ［J] . Theor Appl Genet, 2004, 109：352-360.

［38] 王麗俠, 程須珍, 王素華. 基于SSR標(biāo)記分析小豆及其近緣植物的遺傳關(guān)系［J] . 生物多樣性, 2011, 19（1）：17-23.