溫度及pH對(duì)胞外乳糖酶酶學(xué)性質(zhì)的影響

秦 操

（河南省新鄉(xiāng)市紅旗區(qū)職業(yè)高中，河南 新鄉(xiāng) 453003）

乳糖酶被國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)命名為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，簡(jiǎn)稱為β-半乳糖苷酶，其能催化乳糖水解生成等摩爾量的葡萄糖和半乳糖[1-4]。

牛乳是營(yíng)養(yǎng)豐富的天然食品，其中乳糖含量約為4.7%～5.0%，是乳中最重要的碳水化合物。對(duì)于體內(nèi)缺乏乳糖酶的人群，乳糖在小腸中不分解而直接進(jìn)入大腸，被大腸中的細(xì)菌酵解產(chǎn)生多種氣體及短鏈脂肪酸，會(huì)導(dǎo)致腹脹、排氣增多、腹痛和腹瀉等不良病癥，被稱為乳糖不耐癥[5]。利用乳糖酶水解乳中的乳糖是解決乳糖不耐癥的最佳途徑，乳糖酶在低乳糖乳及乳制品中的應(yīng)用對(duì)于乳品加工具有重要意義。

微生物來(lái)源乳糖酶的研究日益受到人們的重視，特別是絲狀真菌產(chǎn)生的乳糖酶因其適宜的pH、良好的穩(wěn)定性、細(xì)胞外分泌和表達(dá)量較高的特點(diǎn)而成為研究的熱點(diǎn)[6-8]。目前，黑曲霉、米曲霉、青霉、毛霉等的乳糖酶已經(jīng)被分離純化[9-12]。本研究所選用的是由亮色毛霉經(jīng)固態(tài)發(fā)酵所獲的胞外高溫乳糖酶，此酶作用溫度較高，反應(yīng)速度快，可以有效地減少雜菌污染，且提取時(shí)不需要破壁處理。為了使此高溫乳糖酶能夠真正用于工業(yè)化生產(chǎn)，本試驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)生的高溫乳糖酶的最適溫度、熱穩(wěn)定性、pH等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)酵原料：麩皮；發(fā)酵菌種：亮色毛酶，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品檢察所；其他培養(yǎng)基材料：酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、葡萄糖等；檢測(cè)試劑盒：ONPG檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海生工生物工程公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

J-25型高速冷凍離心機(jī)、DL201型恒溫自動(dòng)干燥箱、BS-2F 恒溫振蕩培養(yǎng)箱、磁力攪拌器、JA2003電子天平、DZKW-C型水浴鍋、HZQ-F160高壓蒸汽滅菌鍋、Delta 320 pH計(jì)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳糖酶固態(tài)發(fā)酵

將麩皮和蒸餾水按比例1∶1.5混合放入250 mL三角瓶中，裝量控制在1/3。其中固體物質(zhì)定量為10 g，攪拌均勻，作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。外加碳源-乳糖為0.05 g·mL-1，外加氮源-蛋白胨0.04 g·mL-1進(jìn)行高壓滅菌，冷卻后按15%的接種量制備菌懸液，將已接種的三角瓶放入30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d[3]。

1.3.2 粗酶液的制備

按料液比（V/W）1∶8 加入水和發(fā)酵過(guò)的麩皮，浸提并勻速攪拌30 min。經(jīng)4層紗布過(guò)濾后即得粗酶液，靜置取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 乳糖酶的純化

采用無(wú)機(jī)絮凝劑對(duì)粗酶液進(jìn)行絮凝處理，在溫度20℃，自然pH 下，加入硫酸鋁0.002 g · mL-1，30 min后出現(xiàn)大量沉淀，收集沉淀即為純化的乳糖酶。

1.3.4 乳糖酶活力測(cè)定

取試驗(yàn)液1 mL加入試管中，于30℃水浴中平衡10 min，快速加入ONPG 底物溶液5 mL（已在30℃水浴中達(dá)到平衡），混合，精確反應(yīng)10 min后，迅速加入碳酸鈉溶液2 mL，混合，室溫下靜止；空白管的制備：將添加ONPG底物溶液與碳酸鈉溶液的順序顛倒，其余對(duì)樣品的處理不變；用分光光度計(jì)在420 nm 處測(cè)定樣品和空白液的吸光度；以1 min 內(nèi)催化ONPG 水解生成1 μmol 鄰硝基酚的酶量為一個(gè)酶活力單位[5]。

1.3.5 溫度對(duì)酶活性的影響

將提純的酶液在30、40、50、60、70、80℃下與ONPG反應(yīng)，通過(guò)比較相對(duì)酶活力的大小，檢測(cè)溫度對(duì)酶活性的影響。

1.3.6 溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

將提純的酶液在30、40、50、60、70℃各處理120 min 后，立即用冷水冷卻，檢測(cè)酶活力，通過(guò)比較相對(duì)酶活力的大小，檢測(cè)溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。

1.3.7 酶低溫保存穩(wěn)定性

將粗酶液和純酶液分別在4℃條件下低溫保存，每隔10 d測(cè)定其酶活力，通過(guò)比較相對(duì)酶活力的大小，考察酶的低溫保存穩(wěn)定性。

1.3.8 pH對(duì)酶活性及穩(wěn)定性的影響

將提純的酶液在不同的pH 下與ONPG 反應(yīng)，測(cè)定其酶活力，通過(guò)比較相對(duì)酶活力的大小，考察pH對(duì)酶活性的影響；將提純的酶液在不同的pH下處理24 h，每隔4 h 測(cè)定其酶活力，通過(guò)比較相對(duì)酶活力的大小，考察pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)酶活性的影響

溫度對(duì)乳糖酶活力的影響見圖1。

圖1 溫度對(duì)乳糖酶活力的影響

溫度是影響酶活性的較主要因素，通常情況下各種酶都會(huì)有一個(gè)最適溫度，在此溫度下酶的活力最高。如果溫度太高會(huì)影響酶蛋白的次級(jí)鍵，使蛋白質(zhì)變性，降低其酶活性。由圖1可見，亮色毛霉乳糖酶的活性在＜60℃時(shí)隨溫度的升高直線上升，＞60℃之后酶活力開始迅速下降，表明其最適作用溫度為60℃，其最適作用溫度較高，屬于高溫乳糖酶，此溫度下可有效防止雜菌的污染。在80℃時(shí)酶活力很低，只有最適酶活力的21%，主要是由于高溫使乳糖酶蛋白分子中的氫鍵、離子鍵等非共價(jià)鍵的斷裂，破壞了酶蛋白的天然結(jié)構(gòu)從而降低其酶活性。

2.2 酶的溫度穩(wěn)定性

酶的溫度穩(wěn)定性見圖2。

圖2 酶的溫度穩(wěn)定性

從圖2可以看出，在30～50℃時(shí)，殘留酶活力約為90%，在60℃下處理相同時(shí)間其殘留酶活力為76.54%，在70℃下處理120 min其殘留酶幾乎全部失活。對(duì)于普通的酶蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，溫度越低穩(wěn)定性越好，溫度越高熱失活越快。所以酶蛋白大部分需要貯存在較低的溫度條件下。亮色毛霉發(fā)酵所獲得的乳糖酶雖然在60℃時(shí)的酶活力最高，但是該溫度下，乳糖酶的穩(wěn)定性較差，其酶活力損失較大，不適合應(yīng)用于需較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間的工業(yè)化生產(chǎn)中，因此從穩(wěn)定性和最大酶活力兩方面考慮，在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中的作用溫度應(yīng)該選在50℃，而不能采用此乳糖酶最大酶活力時(shí)的溫度60℃。在50℃附近既能夠在一定程度上減少雜菌的污染，同時(shí)又可以延長(zhǎng)其使用時(shí)間，降低生產(chǎn)成本。

2.3 酶的低溫保存穩(wěn)定性

酶的低溫保存穩(wěn)定性見圖3。

圖3 酶的低溫保存穩(wěn)定性

由圖3可見，不管是粗酶液還是純酶液都具有較高的低溫穩(wěn)定性。但純酶液在低溫保存中的損失率要低于粗酶液。純?nèi)樘敲傅鞍自诘蜏刭A存20 d后酶活才開始降低。主要是由于純酶液在提純過(guò)程中去除了蛋白酶，從而消除了蛋白酶對(duì)乳糖酶蛋白的降解作用，從而提高了其穩(wěn)定性。

2.4 pH對(duì)酶活力的影響

pH對(duì)酶活力的影響見圖4。

圖4 pH對(duì)乳糖酶酶活力的影響

由圖4可見，乳糖酶作用的最適pH為4.5。當(dāng)pH超過(guò)6.0時(shí)酶活顯著降低（P＜0.05），主要原因可能是由于酸堿的變化影響酶蛋白活性中心氨基酸殘基的解離情況所引起的。

2.5 pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

乳糖酶的pH穩(wěn)定性見圖5。

圖5 酶的pH穩(wěn)定性

不同的pH 也會(huì)對(duì)酶的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。通過(guò)對(duì)酶的pH穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，可以找到能夠使酶保持相對(duì)穩(wěn)定的pH 條件，使酶達(dá)到最大酶活力限度，從而對(duì)酶進(jìn)行貯藏或生產(chǎn)，由圖5可見，pH 穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，該酶的穩(wěn)定范圍在4.0～5.5。

3 討 論

目前，工業(yè)生產(chǎn)中用于分解乳糖的乳糖酶多從酵母、曲霉菌或乳酸菌中經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)酶后提取獲得，但均不耐熱，僅能在常溫下工作[13]。因在常溫下化學(xué)反應(yīng)速度較慢，所需時(shí)間長(zhǎng)，容易受到細(xì)菌污染而發(fā)生變質(zhì)。此外，為縮短水解時(shí)間，所需添加的酶量又較大，因此成本也高。而高溫乳糖酶在工業(yè)應(yīng)用中具有突出的優(yōu)點(diǎn)，如水解溫度高、酶反應(yīng)速度快、酶用量低、反應(yīng)時(shí)間短、省時(shí)省力并且能防止雜菌污染等。因此，高溫乳糖酶的研究日益引起人們的重視。李寧等對(duì)黑曲霉D2-26高溫乳糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其最適溫度為70℃，在30～60℃有較高的耐受性；最適pH為2.5，pH穩(wěn)定范圍在2.0～9.0；Mn2+對(duì)乳糖酶活性有顯著的激活作用（P＜0.05），Hg2+、Pb2+對(duì)酶活有較強(qiáng)的抑制作用[14]。蔣燕靈等對(duì)從棲熱菌中分離得到的耐熱乳糖酶的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該耐熱乳糖酶的等電點(diǎn)約為7.2，不同于其他來(lái)源的乳糖酶[15]。史應(yīng)武等從101株低溫菌中發(fā)現(xiàn)了1株產(chǎn)高溫β-半乳糖苷酶菌株G2005，該酶的最適pH為6.5，最適作用溫度為50℃，在30～60℃范圍內(nèi)，具有較好的穩(wěn)定性；Mg2+增強(qiáng)酶活，而Hg2+、Gu2+、Mn2+抑制酶活[16]。

本試驗(yàn)探討了溫度、pH 對(duì)亮色毛霉經(jīng)固態(tài)發(fā)酵所獲得的高溫乳糖酶的活性及穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明，該酶的最適溫度是60℃，此溫度下可有效防止雜菌的生長(zhǎng)，降低了生產(chǎn)過(guò)程中雜菌污染的風(fēng)險(xiǎn)；在4℃保存中，純酶液、粗酶液的酶活性均呈現(xiàn)較高的穩(wěn)定性，但純酶液的酶活力變化不大，主要是由于在提純過(guò)程中除去了蛋白酶；pH 對(duì)酶穩(wěn)定性范圍是4.0～5.5，在最適pH 4.5 的附近，此酸度下，細(xì)菌的生長(zhǎng)速度受限，進(jìn)一步提高產(chǎn)品的保存質(zhì)量為亮色毛霉乳糖酶的生產(chǎn)和儲(chǔ)藏條件提供了參考依據(jù)。

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