6味中草藥及配伍方劑提取物對3株大腸桿菌的體外抑菌試驗

王瑩瑩，付小寶，于 聰，李 冰，王雪瑩，郝景鋒

（吉林農(nóng)業(yè)科技學院動物醫(yī)學學院，吉林 吉林 132101）

隨著在防疫與治療上對抗生素的依賴性逐漸增大，耐藥性、藥物殘留等問題接踵而至，大腸桿菌又屬于多血清型和變異性強的細菌，極易產(chǎn)生耐藥性[1-2]。中草藥以其抗菌消炎、不易產(chǎn)生耐藥性、無毒（低毒）、無殘留（低殘留）等特點脫穎而出[3]。試驗選用6味中草藥及其配伍方劑提取物對3株大腸桿菌進行了體外抑菌實驗，以期為臨床治療提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株：大腸桿菌1（O111∶K58）、大腸桿菌2（O128∶K67）、大腸桿菌3（O44∶K74），來自吉林農(nóng)業(yè)大學預防獸醫(yī)學微生物實驗室。培養(yǎng)基：普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、ss瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁肉湯培養(yǎng)基（加微量酚紅）。單味藥物：板藍根、黃連、魚腥草、金銀花、蒲公英、大青葉。配伍方劑：方劑一由黃連、魚腥草、蒲公英組成；方劑二由板藍根、黃連、魚腥草、金銀花、蒲公英、大青葉組成；方劑三由金銀花、板藍根、魚腥草、黃連、大青葉組成。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥液制備

每味中草藥均按照水提法進行煎煮，加熱至沸后改用文火保持30 min，用紗布過濾，重復2 次，合并3次濾液，濃縮至含生藥1g·mL-1，1000 rpm離心15 min，取上清液置于試管中備用，按照配伍方劑要求，分別取等量藥液，配出3個配伍方劑，置于試管中，調(diào)pH 至7.4～7.6，100℃滅菌10 min后，4℃保存?zhèn)溆肹4]。

1.2.2 培養(yǎng)基制備

普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、ss瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁肉湯培養(yǎng)基（加入微量酚紅），均按照常規(guī)方法配制，調(diào)pH至7.2～7.6，高壓滅菌，制成平板培養(yǎng)基（除肉湯培養(yǎng)基外），冷卻后置于無菌室備用。

1.2.3 菌液制備

從分離菌株試管的斜面上挑取2～3接種環(huán)的細菌分別接種于SS 瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～18 h后，觀察大腸桿菌的生長情況，從牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上挑取乳白色的單個菌落，接種于5 mL 普通營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)24～36 h，取0.5 mL 于普通瓊脂平板上培養(yǎng)8～12 h，用滅菌生理鹽水洗下菌落并稀釋，后用平皿傾注法估測活菌數(shù)后稀釋至1.0×109cfu·mL-1，即為試驗菌液。

1.2.4 最小抑菌濃度

采用試管二倍稀釋法，向滅菌試管中加入改良馬丁肉湯培養(yǎng)基1 mL，依次編號，在第1管內(nèi)加入藥液1 mL，混勻后吸取1 mL，至第2管，依次類推至第9管棄去1 mL，然后于每管中加入改良的馬丁肉湯培養(yǎng)基0.1 mL作103稀釋（約含1.0×105cfu·mL-1）的菌液，第10 管作為陽性對照，第11 管作為陰性對照。第1管至第9管藥物濃度分別為1000、500、250、125、62.5、31.3、15.7、7.8、3.9 mg·mL-1，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。以培養(yǎng)物透明、不顯紅色的藥物濃度為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。從該試管中取培養(yǎng)物0.01 mL 接種到普通瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24～48 h，以菌落數(shù)＜3個視為無細菌生長，以無細菌生長的藥物最低濃度作為該藥的最小殺菌濃度（MBC）。重復試驗3次，取平均值。

2 試驗結(jié)果

6 味中草藥及其配伍方劑對3 種血清型大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度見附表。

附表 6味中草藥及配伍方劑對3種大腸桿菌的MIC和MBC mg

由附表可以看出，單味黃連和方劑三的MIC值最小，表明黃連和方劑三對所選用的大腸桿菌1（O111∶K58）、大腸桿菌2（O128∶K67）和大腸桿菌3（O44∶K74）抑菌效果較明顯。

3 討 論

3.1 發(fā)病原因

大腸桿菌病主要發(fā)生于密集化養(yǎng)禽場，各種禽類不分品種性別、日齡均對本菌易感。幼齡禽類發(fā)病最多，污穢、擁擠、潮濕、通風不良的環(huán)境，過冷過熱或溫差很大的氣候，有毒有害氣體（氨氣或硫化氫等）長期存在，飼養(yǎng)管理失調(diào)，營養(yǎng)不良（特別是維生素的缺乏）以及病原微生物（如支原體及病毒）感染所造成的應激等均可導致本病的發(fā)生[5-6]。

3.2 耐藥性分析

大腸桿菌病已經(jīng)成為威脅畜禽業(yè)發(fā)展的主要細菌性疾病之一。大腸桿菌的血清型較多，具有地域差異性，在防治上多采用抗生素治療，但由于其極易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留等現(xiàn)象，因此急需另一種治療方式進行優(yōu)化，而中草藥治療以其抗菌、消炎、不易產(chǎn)生耐藥性的特點脫穎而出。劉麗艷以白頭翁、黃連、板蘭根、大青葉、甘草等藥物為主組成的中草藥組方按0.5%～1%比例拌料或加入飲水中，結(jié)果表明，在感染的不同時期，用中草藥防治大腸桿菌病，預防組保護率在94%，比對照組高14%；治療組在感染的不同時期用藥，其最高保護率有很大差異，平均保護率達90.67%，比對照組高8.67%；對蛋種雞的預防性試驗表明，發(fā)病率與病死率均較低，分別為1.8%、11.1%，比對照組低2.7%、13.3%；治療組最高保護率達90%，比對照組高7%。有效率達100%，比對照組高10%，對三黃肉雞治愈率達94%，比對照組高8%[7]。潘樹橋等針對性地選取對本地區(qū)大腸埃希氏菌有抑菌作用的中藥組成黃芩散經(jīng)對人工感染雞和現(xiàn)地應用，結(jié)果表明，用于防治肉用仔豬大腸桿菌病具有良好的效果，總保護率達93.0%[8]。

3.3 藥敏試驗分析

在特定環(huán)境下孵育24 h，可抑制某種微生物出現(xiàn)明顯增長的最低藥物濃度即最小抑菌濃度，用于定量測定體外抗菌活性[9]。李淑梅等選用黃連、黃芩、梔子、石榴皮、大黃5味中草藥，采用煎煮法提取有效成分，并對這5味中藥提取物在體外對致病性大腸桿菌的抑菌效果進行了測定，試驗結(jié)果表明，不同中藥提取物在不同濃度時對大腸桿菌有不同的抑制作用，黃連、黃芩對試驗菌株的抑菌作用最強，而其他3 味藥物在高濃度時有效，低濃度時無效；黃連、黃芩、大黃3味藥物組合能增加抑菌效果，黃連、黃芩和梔子組合也能加強抑菌效果，而在配方中加入石榴皮的抑菌效果增加不顯著（P＜0.05）[10]。劉玉慶等用平板法、管碟稀釋法檢測大腸桿菌、沙門氏桿菌、芽胞桿菌對23種單味中藥、復方清熱解毒類中藥的敏感性，試驗結(jié)果表明，黃芩、秦皮、黃連、大黃、連翹、金銀花、夏枯草、石榴皮等具有清熱解毒、瀉火燥濕功用的藥物抑菌效果較好，以三黃湯為基礎方的清熱解毒類復方中草藥抑菌作用好，對大腸桿菌的MIC為125～500 mg·mL-1，復方中草藥比單味MIC高[11]。

本試驗利用二倍稀釋法測定各血清型大腸桿菌的最小抑菌濃度，通過在培養(yǎng)基中加入指示劑而鑒定抑菌情況。若培養(yǎng)基不變紅色時，說明無細菌生長或僅有少量細菌生長，這樣便可以更直觀的判斷結(jié)果。由于每種中草藥及各配伍方劑的藥性與抑菌作用各不相同，因此對3株大腸桿菌的抑菌程度不同，因此各自的最小抑菌濃度也各有區(qū)別。由于黃連對該菌的抑制作用較強，因此黃連的MIC最小，而方劑三的MIC次之。單味中藥抑菌作用較好，但方劑也有其優(yōu)勢。方劑不僅可以抑菌，同時還有調(diào)理動物機體的作用，從而增強其抵抗力。試驗結(jié)果表明，單味中草藥黃連以及由金銀花、板藍根、魚腥草、黃連、大青葉組成的方劑三對大腸桿菌具有良好的抑菌作用。

4 結(jié) 論

試驗結(jié)果表明，單味中草藥黃連以及由金銀花、板藍根、魚腥草、黃連、大青葉組成的組方對大腸桿菌具有良好的抑菌作用。

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