Cu2+絡(luò)合物紫外法測(cè)定果糖含量

王雅萍，薛繼楊，張瑤紓

（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津300070）

果糖是左旋性的六碳酮糖，是葡萄糖的同分異構(gòu)體，為最甜的天然甜味劑[1－3]，被廣泛應(yīng)用于冷凍食品、飲料、面包以及乳制品等食品中。相比其他糖類，果糖具有以下優(yōu)點(diǎn)：甜度高；天然，綠色安全；風(fēng)味口感好；代謝途徑與胰島素?zé)o關(guān)。然而高果糖飲食可以促進(jìn)脂肪合成，從而增加患肥胖癥、胰島素抵抗和心血管等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4－5]。因此控制食品中果糖的含量是十分必要的。

目前常用的果糖含量測(cè)定方法有很多，如紫外分光光度法[6－8]、高效液相色譜法[9－10]、高效液相色譜－熒光檢測(cè)法[11]等。以上含量測(cè)定方法中，紫外分光光度法中使用的間苯二酚、鐵氰化鉀、濃鹽酸等，對(duì)人體和環(huán)境都有損害作用；高效液相色譜法儀器昂貴，操作不方便?？紤]到上述不足，本實(shí)驗(yàn)采用快速方便的紫外分光光度法結(jié)合Cu2+絡(luò)合法[12－13]測(cè)定果糖含量，具有省時(shí)、快速、方便、精密度高的優(yōu)點(diǎn)。

1 儀器與材料

UV－265FW紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；BP221S型電子天平：德國(guó)Sartorius公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

D－果糖原料：蚌埠豐原涂山制藥有限公司，批號(hào)（110720）；D－果糖對(duì)照品：中國(guó)食品藥品檢定所，1504－200001；氫氧化鈉（分析純）：天津市文達(dá)稀貴試劑化工廠；硫酸銅（分析純）、濃鹽酸（分析純）：天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

對(duì)照品溶液：精密稱取D－果糖對(duì)照品25 mg置于50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 ml置于50 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻即得（濃度約為0.10 mg/mL）。

原料供試品溶液：精密稱取D－果糖原料25 mg置于50 mL量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 mL置于50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻即得（濃度約為0.10 mg/mL）。

氫氧化鈉溶液：精密稱取氫氧化鈉1g置于100mL量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度，搖勻即得（濃度約為1.0%）。

硫酸銅溶液：精密稱取硫酸銅1g置于100mL量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度，搖勻即得（濃度約為1.0%）。

2.2 測(cè)定條件的選擇

2.2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

精密量取對(duì)照品溶液0.5 mL置于10 mL量瓶中，加入0.10%的硫酸銅溶液0.8 mL，0.20%的氫氧化鈉溶液2.0 mL，加水至刻度，搖勻過(guò)濾。另取對(duì)照品溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻過(guò)濾。

按照《中國(guó)藥典》2010年版（二部）附錄ⅣA紫外－可見(jiàn)分光光度法，在200 nm～900 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，果糖對(duì)照品溶液在237 nm處有吸收峰，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為237 nm，掃描結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 果糖溶液掃描圖Fig.1 UV spectra of fructose

圖2 經(jīng)Cu2+絡(luò)合后果糖溶液掃描圖Fig.2 UV spectra of fructose with Cu2+

2.2.2 單因素考察試驗(yàn)

2.2.2.1 氫氧化鈉濃度考察

精密量取對(duì)照品溶液各0.5 mL置于10 mL量瓶中，分別加入0.05%的硫酸銅溶液0.5 mL及0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%的氫氧化鈉溶液各2.0 mL，加水至刻度，搖勻即得。同法配制空白溶液。過(guò)濾，以空白液為參比，于237 nm處測(cè)定吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖3，選擇0.10%，0.15%，0.20%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 氫氧化鈉不同濃度考察結(jié)果Fig.3 Results of different NaOH concentrations

2.2.2.2 硫酸銅濃度考察

精密量取對(duì)照品溶液各0.5 mL置于10 mL量瓶中，分別加入0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.15%的硫酸銅溶液0.5 mL及0.10%的氫氧化鈉溶液各2.0 mL，加水至刻度，搖勻即得。同法配制空白溶液，過(guò)濾，以空白液為參比，于237 nm處測(cè)定吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖4，選擇0.05%、0.10%、0.15%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 硫酸銅不同濃度考察結(jié)果Fig.4 Results of different CuSO4concentrations

2.2.2.3 氫氧化鈉用量考察

精密量取對(duì)照品溶液各0.5 mL置于10 mL量瓶中，分別加入0.05%的硫酸銅溶液0.5 mL及0.10%的氫氧化鈉溶液 0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL，加水至刻度，搖勻即得。同法配制空白溶液，過(guò)濾，以空白液為參比，于237 nm處測(cè)定吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖5，選擇2.0、2.4、2.8 mL 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 氫氧化鈉不同用量考察結(jié)果Fig.5 Results of different NaOH volumes

2.2.2.4 硫酸銅用量考察

精密量取對(duì)照品溶液各0.5 mL置于10 mL量瓶中，分別加入 0.05%的硫酸銅溶液 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL 及 0.10%的氫氧化鈉溶液各2.0 mL，加水至刻度，搖勻即得。同法配制空白溶液，過(guò)濾，以空白液為參比，于237 nm處測(cè)定吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖6，選擇0.6、0.7、0.8 mL進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖6 硫酸銅不同用量考察結(jié)果Fig.6 Results of different CuSO4volumes

2.2.3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液0.5 mL置于10 mL量瓶中，結(jié)合以上結(jié)果，設(shè)計(jì)正交表，重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到如下結(jié)果（見(jiàn)表1）。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平考察表Table 1 The factors and levels of affecting determination in orthogonal test

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果可得用于果糖含量測(cè)定的最佳試劑條件為：0.10%的硫酸銅溶液0.8 mL，0.20%的氫氧化鈉溶液2.0 mL。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品溶液 0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55 mL置于10 mL量瓶中，分別加入0.10%的硫酸銅溶液0.8 mL，0.20%的氫氧化鈉溶液2.0 mL，加水至刻度，搖勻即得。同法配制空白溶液，過(guò)濾，以空白液為參比，于237 nm進(jìn)行測(cè)定。以吸光度值（A）對(duì)濃度（C）作圖，經(jīng)線性回歸，得方程 A=17.614C－0.095 8，r=0.999 9。結(jié)果表明果糖在0.015 mg/mL～0.05 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Results and design of orthogonal test

2.4 精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液0.4 mL置于10 mL量瓶中，依2.3方法操作，連續(xù)測(cè)定6次，RSD值為0.08%，表明本方法精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密量取對(duì)照品溶液5份，每份0.4 mL置于10 mL量瓶中，分別依2.3方法操作，RSD值為0.52%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液0.4 mL置于10 mL量瓶中，依 2.3 方法操作，分別于 0、10、20、30、40、50、60 min 時(shí)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得30 min內(nèi)RSD值為1.55%，60 min內(nèi)RSD值為3.49%，結(jié)果表明含量測(cè)定的時(shí)間應(yīng)控制在30 min內(nèi)。

2.7 回收率試驗(yàn)

分別精密量取適量對(duì)照品溶液配制成低、中、高3種濃度，依2.3方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.8 含量測(cè)定

用本方法和文獻(xiàn)紫外濃鹽酸法[6－8]分別測(cè)定果糖原料供試品，測(cè)得平均含量分別為99.12%和99.18%，利用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩種方法測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。本方法可用于果糖含量測(cè)定。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Table 3 Results of recovery test（n=9）

3 討論

果糖分子結(jié)構(gòu)中，氧和氮原子上均有未成鍵電子對(duì)，在堿性條件下可與硫酸銅形成藍(lán)色絡(luò)合物，且顯色反應(yīng)穩(wěn)定性良好。

本法在顯色過(guò)程中應(yīng)先向待測(cè)溶液中加入硫酸銅溶液，后加氫氧化鈉溶液，否則易產(chǎn)生氫氧化銅沉淀，影響顯色反應(yīng)。

正交試驗(yàn)中極差的大小反應(yīng)各因素對(duì)指標(biāo)影響程度，經(jīng)過(guò)多次正交試驗(yàn)得到表2中的平均吸光值，極差分析結(jié)果顯示各因素對(duì)果糖含量測(cè)定影響為：硫酸銅＞氫氧化鈉，再根據(jù)各個(gè)因素水平的均值比較后得到果糖含量測(cè)定的最佳試劑條件為：0.10%的硫酸銅溶液0.8 mL，0.20%的氫氧化鈉溶液2.0 mL。依照此條件進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證并測(cè)定果糖含量，結(jié)果表明此方法結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性良好。

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