谷物中黃曲霉毒素B1檢測方法的研究

李海礁，喻東威，劉志楠，李欣，解鑫，劉曉川，趙媛，宋曉東，劉萍萍

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司質(zhì)量安全管理系統(tǒng)中心實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 011500）

黃曲霉毒素是黃曲霉、寄生曲霉、特異曲霉和假溜曲霉4 種產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物。飼料在自然條件下污染的黃曲霉毒素主要包括B1、B2、G1及G24 種，其中B1最多、G1次之，B2和G2很少[1]。因為黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1）的毒性與致癌性最大[2]。一般以AFB1作為飼料和糧食中黃曲霉毒素含量評價的主要指標(biāo)，所以我國只針對污染范圍最廣、危害最大的AFB1制定了限量[3]，其中玉米、玉米油、玉米制品中的限量水平均為≤20 μg/kg。

自20 世紀(jì)90 年代以來，現(xiàn)有的檢測黃曲霉毒素B1的方法主要有薄層色譜法（TLC）、液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫法（ELISA）[4-5]。其中，TLC法是檢測黃曲霉毒素的經(jīng)典方法，是中國測定食品及飼料中AFT 黃曲霉素B1（AFB1）的標(biāo)準(zhǔn)方法之一GB/T5009.23-2006《食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定》；高效液相色譜法采用單克隆抗體免疫技術(shù)，通過黃曲霉毒素免疫親和柱可以將黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2分別進(jìn)行定量分析，所以此方法已被美國官方分析化學(xué)家協(xié)會（AOAC）確認(rèn)為官方檢測方法；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有比高效液相色譜法更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但這種方法還極少使用在測定組織中霉菌毒素的含量[6-7]；酶聯(lián)免疫法檢測AFB1的理論基礎(chǔ)是通過抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，其采用單克隆或多克隆抗體技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、分析時間短的優(yōu)點。

本實驗主要采用高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫法，對SGS 能力驗證中心實驗室制備的同一含黃曲霉毒素B1陽性玉米粉樣品進(jìn)行不同實驗室間檢測比對，意在對以上兩種方法進(jìn)行對比研究。

1 材料與方法

1.1 材料

含黃曲霉毒素B1的玉米粉：SGS 能力驗證中心實驗室制備。

1.2 試劑與儀器

黃曲霉毒素B1快速定量檢測試劑盒：美國Helica公司；甲醇（色譜級）；苯（色譜純）；乙腈（色譜純）；氯化鈉（分析純）；磷酸氫二鈉（分析純）；磷酸氫二鉀（分析純）；氯化鉀（分析純）；吐溫-20/PBS 溶液（0.1%）；黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：Supelcd 公司，LB92973，0.100 mg/mL；柱后衍生溶液（0.05%碘溶液）；

XS204 電子天平（感量0.1 mg）：Mettler Toledo 公司；ELX808 酶標(biāo)儀：450 nm，BioTek 公司；微量可調(diào)移液器：100 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL，Brand 公司；八道移液器：30 μL～300 μL，Brand 公司；加樣槽；DZSB-0882 高速均質(zhì)器：iUL 公司；黃曲霉毒素免疫親和柱：3 mL，VICAM；玻璃纖維濾紙（直徑11 cm，孔徑1.5 μm）；玻璃注射器（10 mL、20 mL）；高效液相色譜儀：戴安3000，帶熒光檢測器；色譜柱：Pickering 公司C18 柱。

1.3 方法

1.3.1 方法概述

酶聯(lián)免疫法：本方法測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板包被有針對黃曲霉毒素B1的特異性單克隆抗體。加入黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液和黃曲霉毒素B1酶標(biāo)記物競爭黃曲霉毒素B1抗體，之后底物溶液在酶的作用下，由無色變?yōu)樗{(lán)色，最后加入終止液顏色由藍(lán)變?yōu)辄S色，在450 nm 處測量吸光度值，并計算樣品中黃曲霉毒素B1的濃度含量。

高效液相色譜法[8]：試樣經(jīng)過甲醇-水提取，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水或吐溫-20/PBS 將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，洗脫液通過帶熒光檢測器的高效液相色譜儀柱后碘溶液衍生測定黃曲霉毒素的含量。

1.3.2 樣品前處理

酶聯(lián)免疫法：取代表性的粉碎樣品5.0 g 與25 mL 70%甲醇溶液混合，強(qiáng)力振蕩3 min，2 ℃～8 ℃3 000×g離心10 min，取清液用于檢測（稀釋倍數(shù)為5）。

高效液相色譜法：準(zhǔn)確稱取經(jīng)過磨細(xì)（粒度小于2 mm）的試樣25.0 g 于250 mL 具塞錐形瓶中，加人5.0 g 氯化鈉及甲醇-水（7 ∶3，體積比）至125.0 mL，以均質(zhì)器高速攪拌提取2 min。定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取15.0 mL 濾液并加入30.0 mL 水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1 次～2 次，至濾液澄清，備用。

1.3.3 參考色譜條件

流動相：甲醇-水（45∶55，體積比）；流速：0.8 mL/min；柱后衍生化系統(tǒng)；衍生溶液：0.05%碘溶液；衍生溶液流速：0.2 mL/min；反應(yīng)管溫度：700 ℃；反應(yīng)時間：1 min。

1.3.4 檢測步驟

酶聯(lián)免疫法：取足夠數(shù)量的預(yù)混孔插入微孔架，每孔加入200 μL 酶標(biāo)記物，100 μL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/kg）和樣品，并用移液器吹打至少3 次，充分混勻；轉(zhuǎn)移100 μL 預(yù)混孔中的液體至包被抗體的微孔中，室溫避光孵育15 min，洗板；加入100 μL 底物到微孔中，充分混合并在室溫暗處孵育5 min；最后加入100 μL 停止液到微孔中充分混合，并在450 nm 處測量吸光度值。

高效液相色譜法：用進(jìn)樣器吸取100 μL 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值（峰高或峰面積），得到黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖。取樣品洗脫液1.0mL加入重蒸餾水定容至2.0 mL，用進(jìn)樣器吸取100 μL 注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定試樣的響應(yīng)值（峰高或峰面積）。經(jīng)過與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖比較響應(yīng)值得到試樣中黃曲霉毒素B1的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法檢測結(jié)果數(shù)值統(tǒng)計情況

針對同一黃曲霉毒素B1陽性玉米粉樣品，在不同實驗室間通過HPLC 法和酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測，所得樣品檢測結(jié)果見表1 所示。

表1 不同實驗室間采用HPLC 法和ELISA 法檢測結(jié)果Table 1 The results among different laboratories by HPLC and ELISA

2.2 不同檢測方法檢測結(jié)果與平均值的偏差情況

針對以上不同方法的檢測結(jié)果與樣品平均值進(jìn)行橫向比較，橫線為不同方法的平均值，具體結(jié)果見表2、圖1 和圖2。

表2 不同方法檢測結(jié)果與平均值的偏差情況Table 2 The deviation between detection results and the mean result

圖1 HPLC 法檢測結(jié)果分布圖Fig.1 The assay results of HPLC

圖2 ELISA 法檢測結(jié)果分布圖Fig.2 The assay results of ELISA

表1、表2、圖1 和圖2 結(jié)果顯示：同一樣品不同實驗室檢測結(jié)果，HPLC 法檢測結(jié)果范圍在12.55 μg/kg～17.43 μg/kg 之間浮動，平均值為15.65 μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.90%；ELISA 法檢測結(jié)果范圍在14.10 μg/kg～18.20 μg/kg 之間浮動，平均值為15.24 μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.83%；由以上數(shù)據(jù)可以得到ELISA 法與HPLC 法檢測谷物中的黃曲霉毒素B1時，實驗結(jié)果非常一致，結(jié)果偏差較小。

3 討論

通過ELISA 法和HPLC 法所得玉米粉中黃曲霉毒素B1的檢測結(jié)果可以看出，ELISA 法與HPLC 法檢測結(jié)果都比較穩(wěn)定，而且兩種方法的檢測結(jié)果也非常一致，由此可見ELISA 法與HPLC 法均可以用于檢測谷物中黃曲霉毒素B1的檢測。

自20 世紀(jì)90 年代以來，就高效液相色譜法而言，該方法通過預(yù)固相多功能萃取柱、免疫親和柱進(jìn)行前處理，并結(jié)合柱前、柱后衍生，采用熒光檢測器對樣品進(jìn)行測定，有檢測靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點，但該方法存在前處理步驟繁瑣，操作復(fù)雜，而且不能進(jìn)行大量樣本同時測定[9]，所以極大的限制了HPLC 法檢測黃曲霉毒素B1的應(yīng)用范圍。而ELISA 法在進(jìn)行樣品檢測時，樣品前處理簡單，操作簡便，方法快速，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，而且檢測成本較低，設(shè)備場所要求低，樣品隨到隨檢，并且還可以同時處理大量樣本進(jìn)行檢測等優(yōu)點[10]，所以在檢測谷物中黃曲霉毒素B1時，ELISA法將會得到更廣泛應(yīng)用。

[1]張東升,趙曉聯(lián).黃曲霉毒素M1 的危害、污染現(xiàn)狀及檢測方法進(jìn)展[J].中國衛(wèi)生檢驗,2004(6)：266-269

[2]衛(wèi)功樹.豬黃曲霉毒素中毒的防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2007(13)：184

[3]王磊,侯玉澤,胡驍飛.黃曲霉毒素的危害及檢測方法研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(2)：123-127

[4]江湖,熊勇華,許楊.黃曲霉毒素分析方法進(jìn)展[J].衛(wèi)生研究,2005,34(3)：252-255

[5]宋歡.液相色譜法測定飼料中的黃曲霉毒素B1[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2001(3)：257-258

[6]李佐卿,謝東軍,孫大為,等.免疫親和柱HPLC 熒光檢測酒中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2[J].光譜實驗室,2001,18(1)：28-31

[7]文鏡.玉米中黃曲霉毒素B1的硅鎂吸附柱層析分離純化及HPLC 的定量分析[J].食品科學(xué),1996(1)：68-70

[8]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 18979-2003食品中黃曲霉毒素的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法[S].北京：中國出版社,2003

[9]劉朝暉,楊冀州,楊向瑩.免疫親和柱熒光光度法在檢測黃曲霉素中的應(yīng)用[J].檢疫檢驗,2000,21(11)：32

[10]黃韜睿,李玉鋒,王鑫.PCR 和ELISA 在食源性致病菌檢測中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2008(9)：182-184