胡椒堿的光異構(gòu)化研究*

郭墨亭，夏學(xué)進(jìn)，黃雪松

1(暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東廣州，510632)2(廣東匯香源生物科技股份有限公司，廣東廣州，510665)

胡椒(Piper nigrum L.)屬胡椒科，是藤本植物，主產(chǎn)于我國(guó)海南，越南等熱帶地區(qū)，是食品工業(yè)中應(yīng)用量最大的調(diào)味料。其所含有的胡椒堿(piperine)屬于酰胺類生物堿，具有鎮(zhèn)靜保肝、抗腫瘤［1］、免疫調(diào)節(jié)［2］、抗氧化［3］、抗?jié)儯?］、抗抑郁［5］、抗驚厥［6］、提高生物的藥物利用率［7］、刺激黑素細(xì)胞增殖［8］等生物活性，因此，為保持胡椒堿的生物活性，有必要在使用胡椒時(shí)最大限度地保持胡椒堿的穩(wěn)定性。

胡椒堿分子結(jié)構(gòu)中，除含有苯環(huán)、吡啶等結(jié)構(gòu)外，還具有全反式共軛雙鍵等結(jié)構(gòu)，由于該結(jié)構(gòu)易于吸收光能而形成全順式或部分順式結(jié)構(gòu)，極易使胡椒堿異構(gòu)成異胡椒堿、異胡椒脂堿和胡椒脂堿［9－10］，這種分子結(jié)構(gòu)的改變，必然影響到胡椒堿的理化性質(zhì)或生物活性。如酰胺類化合物生物活性，就與其酰胺鍵的二面角有關(guān)，具有反式結(jié)構(gòu)的桂皮酰胺類生物堿具有抗驚活性，而具有順式結(jié)構(gòu)桂皮酰胺類生物堿則通常具有中樞神經(jīng)興奮作用［11］。由此推測(cè)，胡椒堿及其異構(gòu)體在生物活性上也應(yīng)當(dāng)存在一定差異。因此，有必要研究清楚光照對(duì)胡椒堿異構(gòu)化的影響規(guī)律，為保持其穩(wěn)定性和生物活性提供依據(jù)。本文擬以純胡椒堿為反應(yīng)物，采用不同的輻照條件處理，探索胡椒堿及其異構(gòu)體的光穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 試劑與原料

圖1 胡椒堿及其異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of piperine isomers

胡椒堿:購(gòu)于西安華萃生物技術(shù)有限公司，純度為98%;甲醇 (色譜純)，Dima Technologic INC;乙腈(色譜純)，J B Baker USA;Na2HPO4，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

胡椒堿異構(gòu)體:參考Kozukue的方法，即通過輻照處理胡椒堿甲醇溶液，使其異構(gòu)化產(chǎn)生異胡椒堿、異胡椒脂堿、胡椒脂堿，再經(jīng)高壓液相色譜法分離得到［10］。通過電子噴霧質(zhì)譜法驗(yàn)證鑒定各異構(gòu)體。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

LC－20AT高效液相色譜儀 (配備SIL－20A自動(dòng)進(jìn)樣器;Class-vp色譜工作站;SPD－M20A光電二極管陣列檢測(cè)器;CTO－10AS VP柱溫箱)，日本島津;0.45 μm微孔濾膜，天津津騰試驗(yàn)設(shè)備有限公司;ZF-I型三用紫外分析儀(8W)，上海顧村電光儀器廠。

1.3 輻照處理

1.3.1 不同輻照時(shí)間處理

取20 mL 0.5 mg/mL胡椒堿-甲醇溶液置于培養(yǎng)皿中，于365 nm 紫外分析儀下每輻照0、0.25、3、6、12、24、48、72 h 后，各取 1 mL 輻照后的胡椒堿-甲醇溶液，過濾膜后注入棕色小瓶中，待HPLC檢測(cè)。

1.3.2 不同輻照波長(zhǎng)處理

取20 mL 0.5 mg/mL胡椒堿-甲醇溶液置于培養(yǎng)皿中，于254 nm紫外分析儀下輻照，后續(xù)處理同1.3.1，并與365 nm輻照處理后的結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3.3 不同光源處理

分別取20 mL 0.5 mg/mL胡椒堿-甲醇溶液置于兩大小一致的培養(yǎng)皿中，分別置于365 nm紫外分析儀和日光燈下照射 0、1、2、3、4、5 h。后續(xù)處理同1.3.1。

1.4 高壓液相色譜(HPLC)法檢測(cè)

利用HPLC檢測(cè)上述胡椒堿異構(gòu)體混合溶液，檢測(cè)條件:色譜柱:Diamonsil C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);洗脫程序:乙腈/25 mmol/L Na2HPO4(體積比60∶40)洗脫40 min;流速:0.5 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:3 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。

依據(jù)各異構(gòu)體峰面積百分比的變化，從而確定胡椒堿的消耗量及其異構(gòu)體的形成量。

2 結(jié)果與討論

2.1 輻照時(shí)間對(duì)胡椒堿穩(wěn)定性的影響

由圖2可看出，(1)胡椒堿的含量從輻照一開始就呈現(xiàn)直線下降的趨勢(shì)，大約1.8 h時(shí)消耗50%，到6 h時(shí)趨于平緩;(2)異胡椒堿和異胡椒脂堿一開始呈直線趨勢(shì)迅速形成，胡椒脂堿3 h后才開始形成，各異構(gòu)體含量均在6 h后趨于平緩。說明隨著輻照時(shí)間的延長(zhǎng)，胡椒堿及其3種異構(gòu)體之間相互轉(zhuǎn)化并形成動(dòng)態(tài)平衡。

圖2 輻照時(shí)間對(duì)胡椒堿穩(wěn)定性的影響(365 nm)Fig.2 Effects of the radiation time on the stability of piperine ismomers(Irradiated with UV light at 365 nm)

由于雙鍵結(jié)構(gòu)光異構(gòu)化反應(yīng)的速度是光波長(zhǎng)和強(qiáng)度的函數(shù)［11］，因此，胡椒堿在受輻照的初期，其含量迅速減少;但當(dāng)超過一定時(shí)間后，胡椒堿光異構(gòu)化則與光照時(shí)間無關(guān)，再增加輻照時(shí)間，對(duì)胡椒堿光異構(gòu)化并無太大影響。胡椒堿異構(gòu)體的光異構(gòu)化也呈現(xiàn)類似的規(guī)律。

2.2 輻照波長(zhǎng)對(duì)胡椒堿穩(wěn)定性的影響

從圖3可看出，(1)365 nm輻照72 h后，胡椒堿損耗72.84%，其3種異構(gòu)體的含量為:異胡椒脂堿(31.63%)＞異胡椒堿 (26.79%)＞胡椒脂堿(14.39%)。(2)254 nm輻照72 h后，胡椒堿損耗61.55%;同時(shí)，異胡椒堿和異胡椒脂堿的形成量分別為36.15%、25.40%，胡椒脂堿未檢測(cè)出，其中，異胡椒堿的形成量高于365 nm條件下的形成量。

圖3 不同輻照波長(zhǎng)對(duì)胡椒堿穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of the radiation wavelengths on the stability of piperine ismomers

胡椒堿的紫外最大吸收波長(zhǎng)為340，365 nm較254 nm更接近該最大吸收，因而更容易引起共振并刺激胡椒堿分子結(jié)構(gòu)形成不穩(wěn)定高能態(tài)狀態(tài)，即更容易使胡椒堿變得不穩(wěn)定而轉(zhuǎn)化成其異構(gòu)體。上述結(jié)果證實(shí)了這一理論推測(cè)。

2.3 不同光源對(duì)胡椒堿穩(wěn)定性的影響

由圖4可看出，(1)在日光燈和365 nm紫外燈照射的情況下，胡椒堿的消耗量相差不大，且胡椒堿及其異構(gòu)體含量的變化趨勢(shì)一致;(2)但日光燈照射時(shí)，異胡椒脂堿的形成量多于365 nm紫外燈輻照的，胡椒脂堿和異胡椒堿的形成量均少于紫外燈輻照。

圖4 不同光源對(duì)胡椒堿穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of the light sources on the stability of piperine ismomers

根據(jù)上述分析，胡椒堿與其異構(gòu)體化規(guī)律明顯;這些規(guī)律性的變化取決于其分子結(jié)構(gòu)中含有的順式或反式烯烴雙鍵。根據(jù)電子激發(fā)理論，這些雙鍵的π-電子受到光激發(fā)后，會(huì)形成一個(gè)非平面的高能過渡狀態(tài)電子，同時(shí)又不斷地回到基態(tài)(平面狀態(tài))［10］。因不同的光照處理所具有的激發(fā)能量波段不同，使得胡椒堿雙鍵的激發(fā)狀態(tài)不同，其回復(fù)到基態(tài)的速度與比率亦不相同。因此，在圖2～圖4中的輻照處理初期，胡椒堿形成異構(gòu)體的速度明顯不同，胡椒堿異構(gòu)化速度為輻照時(shí)間和波長(zhǎng)的函數(shù);但當(dāng)輻照處理到足夠時(shí)間后，非平面的高能過渡狀態(tài)雙鍵與平面狀態(tài)的基態(tài)雙鍵則達(dá)到了平衡狀態(tài)時(shí)，延長(zhǎng)光照處理時(shí)間，輻照處理胡椒堿形成異構(gòu)體的速度不再變化。至于各種輻照處理能級(jí)與所形成異構(gòu)體比例之間的定量關(guān)系則有待進(jìn)一步研究確定。

3 結(jié)論

輻照處理胡椒堿溶液，因不同波長(zhǎng)所具有的激發(fā)能量波段不同，使得胡椒堿雙鍵的激發(fā)狀態(tài)不同，因此，在輻照處理初期，胡椒堿異構(gòu)化速度為輻照時(shí)間和波長(zhǎng)的函數(shù);而一段時(shí)間后，胡椒堿及其異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)化并形成動(dòng)態(tài)平衡。365 nm較254 nm更接近胡椒堿的紫外最大吸收波長(zhǎng)340 nm，更容易引起共振并刺激胡椒堿分子結(jié)構(gòu)形成不穩(wěn)定高能態(tài)狀態(tài)，因此365 nm輻照對(duì)胡椒堿異構(gòu)化的影響比254 nm輻照大。而運(yùn)用不同的光源處理，胡椒堿的損耗量差不多，但利于形成的異構(gòu)體不同。因此在避光條件下有利于胡椒堿的穩(wěn)定和保存。

［1］ Pradeep C R，Kuttan G.Effect of piperine on the inhibition of lung metastasis induced B16F－10 melanoma cells in mice［J］.Clin Exp Metastasis，2002，19(8):703 －708.

［2］ Sunila E S，Kuttan G.Immunomodulatory and antitumor activity of piper longum linn.and piperine［J］.J Ethnopharmacol，2004，90(2/3):339 －346.

［3］ Price S E，Harris S A D，Deborah J，et al.Piperine，an active ingredient of black pepper attenuates acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice［J］.Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2010，3(12):971 －976.

［4］ Morikawa T，Matsuda H，Yamaguchi I，et al.New amides and gastroprotective constituents from the fruit of Piper chaba［J］.Planta Med，2004，70:152 －159.

［5］ 胡園，廖紅波，劉屏等.胡椒堿調(diào)節(jié)大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸抗抑郁作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2009，7(7):667－670.Hu Y，Liao H B，Liu P，Guo D H，et al.Antidepressant effects of piperine and its neuroprotective mechanism in rats［J］.J Chin Integr Med，2009，7(7):667 － 670.(in Chinese)

［6］ D’Hooge R，Pei Y Q，Raes A，et al.Anticonvulsant activity of piperine on seizures induced by excitatiory amino acid receptor agonists［J］.Arzneimittel-Forschung，1996，46(6):557－560.

［7］ Kasibhatta R，Naidu M U R.Influence of piperine on the pharmacokinetics of nevirapine under fasting conditions:A randomised，crossover， placebo-controlled study［J］.Drugs R＆D，2007，8(6):383－391.

［8］ Amala S，Radhakrishnan V，Meghna J，et al.UV irradiation affects melanocyte stimulatory activity and protein binding of piperine［J］.Photochem Photobiol，2006，82(6):1 541－1 548.

［9］ Ternes W，Krause E L.Characterization and determination of piperine and piperine isomers in eggs Anal Bioanal Chem，2002，374:155－160.

［10］ Kozukue N，Park M S，Choi S H，et al.Kinetics of lightinduced cis-trans isomerization of four piperines and their levels in ground black pepper as determined by HPLC and LC/MS［J］.J Agric Food Chem，2007，55:7 131 －7 139.

［11］ 黃鴻新，羅一帆，許旋.桂皮酰胺類化合物分子扭角與抗驚活性的關(guān)系［J］.數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，1997，10(3):256－258.