RNA 干涉介導(dǎo)大鼠成肌細(xì)胞系L6中MuRF-1與FOXO3a基因表達(dá)變化的研究

達(dá)志峰 賈英偉 丁潔 朱志祥 馮勇 韋建 梁炳生

?論著?

RNA 干涉介導(dǎo)大鼠成肌細(xì)胞系L6中MuRF-1與FOXO3a基因表達(dá)變化的研究

達(dá)志峰 賈英偉 丁潔 朱志祥 馮勇 韋建 梁炳生

目的探討RNAi技術(shù)體外抑制MuRF-1或FOXO3a基因表達(dá)的效果，為RNAi介導(dǎo)的失神經(jīng)骨骼肌萎縮基因治療奠定基礎(chǔ)。方法體外培養(yǎng)大鼠成肌細(xì)胞系L6，將MuRF-1和（或）FOXO3a siRNA重組質(zhì)粒在Lipofectamine 2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染，優(yōu)化與檢測系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率；將2 μg MuRF-1或FOXO3a基因siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L6，轉(zhuǎn)染后48 h與72 h，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測siRNA重組質(zhì)粒對MuRF-1和FOXO3a的mRNA的抑制效果，使用Western印跡檢測siRNA重組質(zhì)粒對MuRF-1和FOXO3a蛋白水平的抑制效果。用單因素方差分析方法和LSD法進(jìn)行組間比較。結(jié)果（1）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24 h，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞中有大量明亮的綠色熒光表達(dá)，顯示系統(tǒng)有較高的轉(zhuǎn)染效率。（2）實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果顯示：MuRF-1與FOXO3a各自的siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h，二者干擾序列在mRNA水平分別明顯抑制了MuRF-1和FOXO3a的表達(dá)，抑制率達(dá)67﹪和54﹪，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），聯(lián)合MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h，干擾序列在mRNA水平明顯抑制了MuRF-1及FOXO3a的表達(dá)，抑制率達(dá)61﹪及58﹪，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；轉(zhuǎn)染后72 h，MuRF-1與FOXO3a各自的siRNA重組質(zhì)粒干擾序列對MuRF-1和FOXO3a的mRNA的抑制率分別達(dá)79﹪和81﹪，聯(lián)合MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒干擾序列對MuRF-1和FOXO3a的mRNA的抑制率達(dá)77﹪及72﹪，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），與48 h相比，抑制效應(yīng)更為明顯。（3）Western印跡灰度分析結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后48 h，干擾序列MuRF-1明顯抑制了MuRF-1蛋白的表達(dá)，抑制率達(dá)61﹪，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），干擾序列FOXO3a明顯抑制了FOXO3a蛋白的表達(dá)，抑制率達(dá)46﹪，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），聯(lián)合MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒干擾序列對MuRF-1和FOXO3a蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)64﹪及42﹪，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；轉(zhuǎn)染后72 h，干擾序列MuRF-1對MuRF-1蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)70﹪，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），干擾序列FOXO3a對FOXO3a蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)72﹪，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），聯(lián)合MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒干擾序列對MuRF-1和FOXO3a蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)73﹪及74﹪，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），與48 h相比，抑制效應(yīng)更為明顯，與對mRNA水平的影響一致。（4）MuRF-1的siRNA重組質(zhì)粒與聯(lián)合MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒干擾序列MuRF-1對MuRF-1的mRNA和蛋白抑制效果相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），F(xiàn)OXO3a的siRNA重組質(zhì)粒與聯(lián)合MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒干擾序列FOXO3a對FOXO3a的mRNA和蛋白抑制效果相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。結(jié)論（1）RNA干擾技術(shù)在體外能夠明顯抑制泛素連接酶MuRF-1和叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a基因的表達(dá)。（2）體外研究中MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)染與各基因siRNA重組質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染其干擾序列對MuRF-1或FOXO3a的mRNA和蛋白抑制效果無差別。（3）活體實(shí)驗(yàn)中MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)染與各基因siRNA重組質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染其干擾序列對MuRF-1或FOXO3a的mRNA和蛋白抑制效果尚不明確，這為RNAi介導(dǎo)的失神經(jīng)骨骼肌萎縮基因治療提供了一種新的思路。

肌萎縮； MuRF-1； FOXO3a； L6； 去神經(jīng)支配； RNA干擾； 基因表達(dá)

隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)日趨機(jī)械化、現(xiàn)代化，另外國內(nèi)私家車數(shù)量大量增加，由此引發(fā)眾多的各種生產(chǎn)和交通事故，從而加大了周圍神經(jīng)損傷的發(fā)生率和致殘率，尤其是臂叢神經(jīng)損傷，可導(dǎo)致嚴(yán)重的肢體功能障礙，給患者造成巨大的痛苦[1]。延緩神經(jīng)損傷后骨骼肌的萎縮，為肌肉重獲神經(jīng)支配爭取時(shí)間，是手內(nèi)肌功能恢復(fù)的關(guān)鍵。最新研究發(fā)現(xiàn)泛素連接酶MuRF-1與“feak-headbox”（FOXO）轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控骨骼肌萎縮最關(guān)鍵的兩個(gè)分子，叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子3a（fork-head protein，F(xiàn)oxO3a）是肌肉蛋白降解的分子開關(guān)之一[2-3]。另一方面，病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)降解的主要機(jī)制是通過泛素蛋白酶體水解通路的激活[4]。Bodine等[5]利用基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)，MuRF-1能有效緩解肌肉萎縮過程，證實(shí)泛素連接酶是骨骼肌肉萎縮過程中的關(guān)鍵酶。本研究通過RNA干涉技術(shù)，在大鼠成肌細(xì)胞系L6中特異性地阻斷MuRF-1和FOXO3a，探討其中MuRF-1和FOXO3a基因與蛋白的表達(dá)變化，探索失神經(jīng)骨骼肌萎縮的發(fā)生機(jī)制，為RNAi介導(dǎo)的失神經(jīng)骨骼肌萎縮基因治療打下基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞系L6購自美國ATCC公司，pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR質(zhì)粒購自上海銳賽生物技術(shù)有限公司，胎牛血清、DMEM（高糖）細(xì)胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶為美國Gibco公司產(chǎn)品，Genelute Plassmid Miniprep Kit為美國Sigma公司產(chǎn)品，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，兔抗大鼠FOXO3a（一抗)為美國Cell Signal公司產(chǎn)品，兔抗大鼠MuRF-1(一抗)為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，山羊抗兔IgG為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，總RNA抽提試劑（Trizol）購自上海生工工程有限公司，cDNA合成隨機(jī)引物及PCR引物委托上海生工工程有限公司進(jìn)行合成。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.獲 取MuRF-1和FOXO3a兩 基 因 的siRNA重組質(zhì)粒：參照文獻(xiàn)[5]獲取MuRF-1和FOXO3a基因miRNA干擾序列，委托上海銳賽生物技術(shù)有限公司構(gòu)建并鑒定siRNA重組質(zhì)粒。

2.分組說明：陰性對照組（序列siRNA CON組）、實(shí)驗(yàn)組A（含MuRF-1基因siRNA重組質(zhì)粒）、實(shí)驗(yàn)組B（含F(xiàn)OXO3a基因siRNA重組質(zhì)粒）、實(shí)驗(yàn)組C（含MuRF-1與FOXO3a基因siRNA重組質(zhì)粒）；轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的大鼠成肌細(xì)胞系L6，用胰酶消化后，將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入適量含10﹪胎牛血清的DMEM（高糖）完全培養(yǎng)液，置于37℃、5﹪CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)60﹪～70﹪時(shí)，取2 μg siRNA重組質(zhì)粒和5 μl Lipofectamine 2000，分別加入Opti-MEM培養(yǎng)液中，終體積為500 μl，室溫孵育20 min；吸取細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)移入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕柔混勻，加培養(yǎng)液至終體積2 ml，置37℃、5﹪CO2孵育48 ～ 72 h，并以未加任何試劑的大鼠成肌細(xì)胞系L6作為對照。其間24 h給細(xì)胞更換DMEM完全培養(yǎng)液。

3.分別于轉(zhuǎn)染后48 h和72 h棄細(xì)胞培養(yǎng)液，按說明書提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用熒光定量PCR試劑檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的MuRF-1和FOXO3a基因表達(dá)，并用PCR軟件分析達(dá)到熒光閾值時(shí)的循環(huán)次數(shù)（cycle threshold，Ct值），用2-ΔΔCt來計(jì)算各組標(biāo)本FOXO3a和MuRF-1基因的表達(dá)強(qiáng)度（表1）。

4.轉(zhuǎn)染48 h和72 h后的細(xì)胞，棄上清，用適量細(xì)胞蛋白裂解液提取蛋白，經(jīng)離心獲得蛋白上清液并行蛋白定量，經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳后，通過電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉后加入一抗（兔抗大鼠FOXO3a多克隆抗體1:300，兔抗大鼠MuRF-1多克隆抗體1:100）和二抗（山羊抗兔IgG1:4000），最后ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，并用BIO-RAD圖像處理軟件進(jìn)行灰度測定，以各因子灰度與內(nèi)參照灰度之比代表組織內(nèi)FOXO3a和MuRF-1蛋白的含量，以各灰度比與對照組灰度比的比值作為各蛋白因子的表達(dá)強(qiáng)度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理各組數(shù)據(jù)，所有PCR及Western印跡檢測數(shù)據(jù)用± s表示。采用單因素方差分析方法和LSD法進(jìn)行各組比較和組間比較，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、獲取MuRF-1和FOXO3a兩基因的siRNA重組質(zhì)粒

根據(jù)大鼠MuRF-1（Gene ID:140939）和FOXO3a（Gene ID:294515）的基因序列分別自行設(shè)計(jì)并合成miRNA oligo，并行測序分析證實(shí)其序列完全準(zhǔn)確（表2）。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物

表2 目的基因miRNA oligo序列

二、MuRF-1和FOXO3a基因siRNA重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后mRNA表達(dá)變化結(jié)果（圖1 ～ 2）

轉(zhuǎn)染后48 h，MuRF-1與FOXO3a各自的siRNA重組質(zhì)粒干擾序列在mRNA水平分別明顯抑制了MuRF-1和FOXO3a的表達(dá)，抑制率達(dá)67﹪和54﹪，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t對照-MuRF-1= 6.401，P ＜ 0.001；t對照-FOXO3a = 5.563，P = 0.001），聯(lián)合MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h，干擾序列在mRNA水平明顯抑制了MuRF-1及FOXO3a的表達(dá)，抑制率達(dá)61﹪及58﹪，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[t對照-聯(lián)合（MuRF-1）= 5.828，P = 0.001；t對照-聯(lián)合（FOXO3a）= 5.975，P = 0.001]。

轉(zhuǎn)染后72 h，MuRF-1與FOXO3a各自的siRNA重組質(zhì)粒干擾序列對MuRF-1和FOXO3a的mRNA的抑制率分別達(dá)79﹪和81﹪，聯(lián)合MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒干擾序列對MuRF-1和FOXO3a的mRNA的抑制率達(dá)77﹪及72﹪，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[t對照-MuRF-1 = 10.425，P ＜ 0.001；t對照-FOXO3a = 9.872，P ＜ 0.001；t對照-聯(lián)合（MuRF-1）= 10.034，P ＜ 0.001；t對照-聯(lián)合（FOXO3a）= 8.878，P ＜ 0.001]，與48 h相比，抑制效應(yīng)更為明顯。MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)染與各基因siRNA重組質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染其干擾序列對MuRF-1或FOXO3a的mRNA抑制效果相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[48 h：tMuRF-1-聯(lián) 合（MuRF-1）=0.573，P = 0.587，tFOXO3a-聯(lián)合（FOXO3a）= 0.412，P = 0.695；72 h：tMuRF-1-聯(lián)合（MuRF-1）= 0.391，P = 0.709，tFOXO3a-聯(lián)合（FOXO3a）=1.110，P = 0.310]。三、MuRF-1和FOXO3a基因siRNA重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)變化結(jié)果（圖3 ～ 5）

轉(zhuǎn)染后48 h，干擾序列MuRF-1明顯抑制了MuRF-1蛋白的表達(dá)，抑制率達(dá)61﹪，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t對照-MuRF-1 = 4.679，P = 0.003），干擾序列FOXO3a明顯抑制了FOXO3a蛋白的表達(dá)，抑制率達(dá)46﹪，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t對照-FOXO3a = 3.117，P = 0.021），聯(lián)合MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒干擾序列對MuRF-1和FOXO3a蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)64﹪及42﹪，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[t對照-聯(lián)合（MuRF-1）= 4.909，P = 0.003；t對照-聯(lián)合（FOXO3a）= 2.846，P = 0.029]。

圖1 MuRF1基因siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h與72 h后RT-PCR結(jié)果

圖2 FOXO3a基因siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h與72 h后RT-PCR結(jié)果

圖3 轉(zhuǎn)染后Western印跡檢測條帶

圖4 MuRF1基因siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h與72 h后Western印跡結(jié)果

圖5 FOXO3a基因siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h與72 h后Western印跡結(jié)果

轉(zhuǎn)染后72 h，干擾序列MuRF-1對MuRF-1蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)70﹪，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t對照-MuRF-1 = 8.631，P ＜ 0.001），干擾序列FOXO3a對FOXO3a蛋白的表達(dá)的抑制率達(dá)72﹪，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[t對照-FOXO3a = 8.283，P ＜ 0.001），聯(lián)合MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒干擾序列對MuRF-1和FOXO3a蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)73﹪及74﹪，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t對照-聯(lián)合（MuRF-1）= 9.008，P ＜ 0.001；t對照-聯(lián)合（FOXO3a）=8.513，P ＜ 0.001]，與48 h相比，抑制效應(yīng)更為明顯，與對mRNA水平的影響一致。

MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)染與各基因siRNA重組質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染其干擾序列對MuRF-1或FOXO3a的蛋白抑制效果相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[48 h：tMuRF-1-聯(lián)合（MuRF-1）= 0.230，P = 0.826，tFOXO3a -聯(lián)合（FOXO3a）= 0.271，P = 0.795；72 h：tMuRF-1-聯(lián)合（MuRF-1）= 0.370，P = 0.724，tFOXO3a-聯(lián)合（FOXO3a）=0.436，P = 0.698]。

討 論

臂叢神經(jīng)損傷后再生距離長，再生速度慢，再生軸突到達(dá)手內(nèi)肌所需時(shí)間長，而手內(nèi)肌肌肉短小，功能精細(xì)，一旦失去神經(jīng)支配，半年內(nèi)即發(fā)生不可逆的組織變性，即使神經(jīng)獲得再支配，也很難恢復(fù)有效的功能[6]。因此，臂叢神經(jīng)損傷所致的手內(nèi)在肌萎縮的防治是周圍神經(jīng)領(lǐng)域亟待解決的一大難題。骨骼肌在失神經(jīng)支配后早期出現(xiàn)快速萎縮的事實(shí)表明：骨骼肌中蛋白代謝的動態(tài)平衡被打破了，蛋白降解速率超過了蛋白合成速率[7]，由此可見，采取有效措施調(diào)節(jié)失神經(jīng)骨骼肌的蛋白代謝，促進(jìn)蛋白合成，抑制蛋白水解甚至逆轉(zhuǎn)失神經(jīng)骨骼肌代謝的負(fù)平衡，將是延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮、為失神經(jīng)骨骼肌重新獲得神經(jīng)支配爭取時(shí)間，并且是促進(jìn)骨骼肌功能恢復(fù)的有效途徑[8]。Tintignac等[9]發(fā)現(xiàn)FOXO3a是與肌萎縮密切相關(guān)的基因，它存在于幾乎全部的肌萎縮類型中。FOXO3a第253位的絲氨酸去磷酸化后，可促進(jìn)骨骼肌蛋白的降解，從而促進(jìn)肌萎縮[10-11]。MuRF-1屬于泛素連接酶，激活MuRF-1是導(dǎo)致肌萎縮的主要機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，小鼠缺乏MuRF-1可抵抗肌萎縮，故MuRF-1可作為在臨床中對抗肌萎縮的靶點(diǎn)[12]。

RNA干涉（RNA interference，RNAi）是一種阻抑基因表達(dá)的新方法，是一種簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具，已成為基因功能研究極其重要的工具[13]。

因此本研究采用RNAi技術(shù)在體外下調(diào)泛素連接酶MuRF-1和FOXO3a基因的表達(dá)，借此為失神經(jīng)骨骼肌萎縮尋找新的治療方法。本研究結(jié)果顯示：采用RNAi技術(shù)特異性的敲除掉與失神經(jīng)骨骼肌萎縮有密切關(guān)系的兩個(gè)基因FOXO3a與MuRF-1，在48 h后檢測發(fā)現(xiàn)聯(lián)合轉(zhuǎn)染組、單獨(dú)轉(zhuǎn)染組與對照組相比較肌萎縮相關(guān)因子的mRNA及蛋白表達(dá)量均被顯著抑制，在72 h后這種抑制效果更加明顯，這表明RNAi技術(shù)在體外能夠明顯抑制泛素連接酶MuRF-1和FOXO3a基因的表達(dá)。但是本研究還發(fā)現(xiàn)MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)染與各基因siRNA重組質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染其干擾序列對MuRF-1或FOXO3a的mRNA和蛋白抑制效果無明顯差別。分析原因可能與FOXO3a可通過不同的方式激活MuRF-1[14]有關(guān)，當(dāng)MuRF-1基因被敲除后FOXO3a也就失去這種激活作用，所以聯(lián)合轉(zhuǎn)染后并沒有出現(xiàn)協(xié)同或者拮抗作用?；铙w實(shí)驗(yàn)中MuRF-1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)染與各基因siRNA重組質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染其干擾序列對MuRF-1或FOXO3a的mRNA和蛋白抑制效果是否與體外研究結(jié)果一致尚不明確，本研究為RNAi介導(dǎo)的失神經(jīng)骨骼肌萎縮基因治療提供了一種新的思路，即聯(lián)合干預(yù)兩類在失神經(jīng)骨骼肌萎縮過程中起重要作用的因子MuRF-1和FOXO3a進(jìn)行基因治療，可能會有更好的療效，這有待于進(jìn)一步研究。

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Study of RNAi-mediated gene downr egulation of ubiquitin ligase MuRF-1 and forkhead activin signal transducer FOXO3a in vitro

DA Zhi-feng*, JIA Ying-wei, DING Jie, ZHU Zhixiang, FENG Yong, WEI Jian, LIANG Bing-sheng,*Department of Orthopaedics (Micro and Hand Surgery), The 2nd Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

LIANG Bing-sheng, Email:liangbs707@yahoo.com

Objective To investigate the effect of RNAi technology in inhibiting gene expression of MuRF-1 or FOXO3a in vitro, establishing a foundation for RNAi mediated gene therapy for denervated skeletal muscle atrophy.MethodsRat muscle cell line L6 was transfected with MuRF-1 or FOXO3a siRNA plasmid using Lipofectamine 2000. After transfection was optimized, 2 μg of MuRF-1 or FOXO3a siRNA recombinant plasmid was transfted. At 48 h and 72 h after transfection, the real-time quantitative PCR was used to detect the inhibition effect of MuRF-1 and FOXO3a. Protein level was evaluated using Western blotting.Results(1) At 24 h after transfection, strong bright green fluorescence was observed under fluorescence microscopy, indicating high transfection efficiency. (2) Real time quantitative PCR analysis showed mRNA expression was significantly inhibited for both MuRF-1 and FOXO3a after 48 h, with an inhibition rate of 67﹪ and 54﹪ respectively. When MuRF-1 and FOXO3a siRNA recombinant plasmids were co-transfectied, MuRF-1 and FOXO3a expression was inhibite by 61﹪ and 58﹪ respectively compared with the control (P ＜ 0.05 for both). At 72 h after transfection, the inhibitory rates for MuRF-1 and FOXO3a siRNA recombinant plasmids at mRNA level were 79﹪ and 81﹪ respectively. When MuRF-1 and FOXO3a siRNA recombinant plasmids were co-transfected, MuRF-1 and FOXO3a mRNA was inhibited by 77﹪ and 72﹪ respectively, significantly higher than the control group (P ＜ 0.05) and higher than that at 48 h. (3) Western blotting showed MuRF-1 and FOXO3a were inhibited by 61﹪ and 46﹪ respectively.When MuRF-1 and FOXO3a siRNA recombinant plasmids were co-transfected, MuRF-1 and FOXO3a protein expression was inhibited by 64﹪ and 42﹪ respectively, both higher than the control (P ＜ 0.05). At 72 h, MuRF-1 and FOXO3a protein expression was inhibited by 70﹪ and 72﹪respectively, significantly greater than the control. Whenunited MuRF-1 and FOXO3a siRNA recombinant plasmids were co-transfected, MuRF-1 and FOXO3a inhibition rates were 73﹪and 74﹪ respectively, significantly greater than the control (P ＜ 0.05). Again, the inhibition was greater at 72 h than at 48 h.ConclusionsRNA interference can obviously inhibit the expression of ubiquitin ligase MuRF-1 and fork protein transcription factors FOXO3a in vitro. Co-transfection of MuRF-1 and FOXO3a siRNA recombinant plasmids can inhibit MuRF-1 and FOXO3a mRNA and protein expression. The inhibition effects were similat to those when the plasmid was tranfected alone.

Muscle atrophy； MuRF-1； FOXO3a； L6； Denervation； RNA Interference； Gene expression

2012-04-19)

(本文編輯：李少婷)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2013.02.007

國家自然科學(xué)青年基金（81000805）

030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科（達(dá)志峰、賈英偉、丁潔、朱志祥、韋建、梁炳生）；上海市第六人民醫(yī)院骨科（馮勇）

梁炳生，Email：liangbs707@yahoo.com

達(dá)志峰，賈英偉，丁潔，等. RNA干涉介導(dǎo)大鼠成肌細(xì)胞系L6中MuRF-1與FOXO3a基因表達(dá)變化的研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志：電子版, 2013, 3(2):87-93.