Mn₂₊驅(qū)動的不同長度DNA片段PCR

廖紅東 陸劍等

摘要：針對傾向錯誤的PCR技術(shù)中不同目的、不同長度基因的誘變種類一直缺乏準(zhǔn)確參考的問題，以酵母spt15基因為研究對象，在標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系中加入不同Mn2+摩爾濃度（0.125，0.250 和0.500 mmol·L-1）進(jìn)行傾向錯誤的PCR，擴(kuò)增spt15不同長度（分別約為200， 500和700 bp）的DNA片段，研究其突變頻率，突變堿基數(shù)目及突變類型，以分析不同種類的突變所需的最佳條件.研究結(jié)果表明：長片段DNA的PCR突變率對Mn2+摩爾濃度更敏感；模板的長度對DNA PCR突變堿基個數(shù)也有較為明顯的影響，低Mn2+摩爾濃度有利于單突變；Mn2+驅(qū)動的突變有明顯的傾向性，其中A→G和T→C的突變居多.

關(guān)鍵詞：突變； 傾向錯誤PCR； 錳離子；DNA片段

中圖分類號：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改造是當(dāng)前蛋白質(zhì)領(lǐng)域研究的熱點之一.由于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系尚不完全明確.因此，在蛋白質(zhì)的基因中加入隨機(jī)突變，然后篩選出性質(zhì)優(yōu)良的突變株，是目前比較可行的方法[1].

目前基因引入隨機(jī)突變的方法很多，主要有：自然傳代突變、物理化學(xué)誘變、DNA重排和傾向錯誤的PCR等.利用易致突變菌株進(jìn)行傳代突變[2]，其突變率高于野生型細(xì)菌，但所需時間較長；化學(xué)致突變劑或物理輻射方法誘變雖然能引入突變[3]，但是突變方向往往不確定，無效突變體比例大，難有較好的篩選標(biāo)記，效率較低；DNA重排（DNA shuffling）[4]，通過序列的隨機(jī)片段化，PCR延伸再重組引起成功突變，但其操作較為復(fù)雜；傾向錯誤的PCR[1，5]，通過調(diào)整PCR的反應(yīng)條件，增加堿基錯配率，即可在100～1 000 bp片段中隨機(jī)引入突變，是最便捷的方法之一.另外，傾向錯誤的PCR可以直接對核酸群體進(jìn)行重復(fù)隨機(jī)突變，使每一次獲得的小突變積累而發(fā)生重要的突變，從而有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改造與功能研究.

湖南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）2013年

第6期廖紅東等：Mn2+驅(qū)動的不同長度DNA片段PCR隨機(jī)突變研究

應(yīng)用傾向錯誤PCR增加突變率的方法包括加入錳離子降低聚合酶對模板的特異性；增加鎂離子的摩爾濃度穩(wěn)定非互補(bǔ)堿基對；使用dITP替代某種dNTP，造成取代突變；增加dCTP和dTTP的摩爾濃度，來提高錯誤摻入率[1，6]， 等等.其中，在標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系中加入適當(dāng)摩爾濃度的錳離子，這種方法操作簡單，產(chǎn)生的突變種類很多.但目前只有針對100 bp左右DNA片段的隨機(jī)突變作了研究[7]，其他長度DNA的隨機(jī)突變條件尚未見報道.因此，我們采用了3種錳離子摩爾濃度，分別對223，521和723 bp長度的DNA片段進(jìn)行傾向錯誤PCR，可以為該隨機(jī)突變方法的應(yīng)用提供較為系統(tǒng)和準(zhǔn)確的參考數(shù)據(jù).

1材料和方法

1.1材料與試劑

野生型酵母BY4741由瑞士弗里堡大學(xué)Rogher Schneiter教授提供；大腸桿菌DH5α由湖南大學(xué)生物院分子生物學(xué)實驗室提供；PYES2質(zhì)粒購自美國invitrogen生命技術(shù)公司.

LA Taq為日本TaKaRa公司產(chǎn)品，T4 DNA連接酶為加拿大MBI公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶為美國NEB公司產(chǎn)品.普通質(zhì)粒小提試劑盒、超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒和超薄瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；氨芐青霉素（Amp）購自美國Sigma公司；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純.

3個不同長度的PCR反應(yīng)引物共4個，見表1.測序所用正向引物序列為5 CGTCAAGGAGAA AAAACCC 3，反向引物序列為5GGGGAGGGCGTAATGTAAG 3，所有引物均由上海生物工程有限公司合成，測序由南京金思特科技有限公司完成.

注：“F”表示正向引物，“R”表示反向引物，括號內(nèi)“S”表示被SacⅠ酶切，括號內(nèi)“K”表示被KpnⅠ酶切，引物序列中的下劃線表示限制性內(nèi)切酶的識別序列.

1.2實驗方法

1.2.1目的基因的準(zhǔn)備

提取酵母總DNA，選取引物wtF1 和wtR1 擴(kuò)增目的基因spt15（723 bp）.100 μL PCR723 bp體系中含有：模板50 ng，引物各20 pmol，dNTP各0.2 mmol/L，10 μL 10×PCR緩沖液，LA Taq酶5U.PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，27個循環(huán)，72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，使用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SacⅠ消化，再次純化后經(jīng)T4 DNA連接酶與相同限制性內(nèi)切酶消化的PYES2載體質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α.在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中挑選適當(dāng)克隆測序，確認(rèn)序列后將克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒PYES2spt15，備用.

1.2.2常規(guī)PCR

以上述制備的重組質(zhì)粒PYES2spt15為模板，分別選取3對引物進(jìn)行223，521和723 bp DNA片段的PCR反應(yīng).反應(yīng)體系同100 μL PCR723 bp體系.反應(yīng)條件除PCR 223 bp 72 ℃延伸1 min，PCR521 bp 72 ℃延伸1.5 min之外，其他均與PCR723 bp的反應(yīng)條件相同.

1.2.3傾向錯誤PCR

反應(yīng)體系及條件同第1.2.2節(jié)，僅分別使用3種Mn2+摩爾濃度（0.125，0.250，0.500 mmol/L），Mn2+單獨配制，不提前與PCR緩沖液混合，防止引起沉淀干擾PCR擴(kuò)增.

2結(jié)果與討論

2.1常規(guī)PCR的突變率

隨機(jī)挑選3個常規(guī)PCR的產(chǎn)物測序，沒有發(fā)現(xiàn)突變位點，可見以此系統(tǒng)為基礎(chǔ)進(jìn)行易錯PCR是可行的.

2.2Mn2+摩爾濃度對不同片段長度DNA PCR

突變率的影響

針對不同長度DNA片段使用了3種Mn2+摩爾濃度（0.125，0.250，0.500 mmol/L）進(jìn)行傾向錯誤PCR，測序后結(jié)果如圖1所示.當(dāng)Mn2+摩爾濃度相同時，隨著DNA片段長度的增加，突變率明顯上升.相同長度DNA片段，隨著Mn2+摩爾濃度的增加，突變率也增加.這證明在PCR體系中加入Mn2+能夠降低DNA合成過程中酶的保真性.其中，723 bp長度的DNA隨著Mn2+摩爾濃度的提高，突變率迅速上升，而短片斷223 bp的DNA對Mn2+摩爾濃度不特別敏感，雖然突變率也有上升，但是僅為長DNA（723 bp）突變率的1/5左右.521 bpDNA對Mn2+摩爾濃度的敏感程度介于兩者之間.可見，長片段DNA PCR的突變率對Mn2+摩爾濃度更敏感.在蛋白質(zhì)基因中，只要有0.11 %的堿基突變就能改變其表型，其他大多數(shù)突變是有害的[8]，而且過多的堿基突變還增加了篩選的負(fù)擔(dān).因此，在選擇隨機(jī)突變PCR的模板時，應(yīng)使用cDNA或僅含有目的序列的雙鏈DNA片段，不宜使用質(zhì)粒DNA以及基因組DNA，使其長度限制在約1 000 bp以內(nèi).對于較長靶DNA的突變，可將其分為若干片段分別進(jìn)行[9].

2.3Mn2+摩爾濃度對不同片段長度DNA PCR突

變堿基個數(shù)的影響

對酶的結(jié)構(gòu)和功能的研究而言，每個基因中1～2個核苷改變（一個氨基酸變化）是較為理想的，即便是在酶的定向進(jìn)化研究中，每個基因中2～7個核苷改變可能更好[10].因此 ，利用易錯PCR技術(shù)對酶進(jìn)行定向進(jìn)化時，選擇合適的突變堿基個數(shù)是定向進(jìn)化技術(shù)的關(guān)鍵.

不同Mn2+摩爾濃度下，不同片段長度DNA易錯PCR突變堿基個數(shù)結(jié)果如表2所示.由表2可以看出，當(dāng)模板長度為223 bp時，易錯PCR的堿基突變以單一堿基突變?yōu)橹鳎?0%）；當(dāng)模板長度為521 bp時，單一堿基突變隨著Mn2+摩爾濃度增加而不斷下降，至Mn2+摩爾濃度為0.500 mmol時，五堿基突變達(dá)到50%；當(dāng)模板長度為723 bp時，低Mn2+摩爾濃度即出現(xiàn)明顯的三突變（為25%），當(dāng)Mn2+摩爾濃度增加至0.500 mmol時，突變均為五堿基突變和六堿基突變（分別占25%和75%）.因此，要取得較多單突變或者更有效的突變體，對DNA片段，尤其是長片段應(yīng)采用低Mn2+摩爾濃度.

2.4Mn2+對不同片段長度DNA突變類型的影響

我們的實驗結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)突變熱點，基本都是點突變，隨機(jī)分布于DNA序列中，插入和缺失率為0.023%，符合Cadwell等[11]的報道.Leung等[12]報道隨機(jī)突變PCR產(chǎn)生相同數(shù)量的轉(zhuǎn)換和顛換突變，而我們的實驗顯示（表3），Mn2+造成突變類型有明顯的傾向性，在75個突變中，A→G和T→C的突變最多，這兩者占了突變總數(shù)的54.67%.轉(zhuǎn)換（76%）是顛換（24%）的3倍多，發(fā)生于A/T的突變占了73.34%，而G/C突變只有26.66%.與其他一些報道相似[8，11].使用Mn2+造成突變類型有明顯的傾向性，可以考慮加入dITP并減少某些dNTP或者調(diào)整4種dNTP的量改變突變類型.

3結(jié)論

DNA隨機(jī)突變技術(shù)是蛋白質(zhì)體外分子進(jìn)化研究的基礎(chǔ)，研究PCR隨機(jī)突變頻率和變化規(guī)律是提高構(gòu)建DNA隨機(jī)突變體庫質(zhì)量和效率的關(guān)鍵.在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中加入Mn2+可以有效地降低Taq DNA聚合酶的保真性，造成堿基的突變.Mn2+離子驅(qū)動的不同長度DNA片段PCR隨機(jī)突變的研究表明：

1）PCR突變率對Mn2+摩爾濃度敏感程度與模板的長度關(guān)系密切，長片段DNA的PCR突變率對Mn2+摩爾濃度更敏感.

2）模板的長度對DNA PCR突變堿基個數(shù)也有較為明顯的影響，欲使隨機(jī)突變體庫有更多單突變或者更有效的突變體，采用低Mn2+摩爾濃度為好.

3）Mn2+驅(qū)動的突變基本都是點突變，隨機(jī)分布于DNA序列中造成突變類型有明顯的傾向性，其中A→G和T→C的突變居多.

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