快速PCR介導(dǎo)的NeuroD—3′UTR的定點(diǎn)突變研究

趙金艷+盧宏+張振武+梁洋

摘要：糖尿病是一種由遺傳和環(huán)境因素共同引起的代謝紊亂綜合征。與肝細(xì)胞核因子有關(guān)的幼年發(fā)病的成人型糖尿?。∕ODY） 屬于特殊類(lèi)型的糖尿病，分為6型，其中Ⅵ 型MODY 為bHLH 家族轉(zhuǎn)錄因子NeuroD 突變引起的疾病。在體內(nèi)NeuroD能夠與A類(lèi)bHLH的轉(zhuǎn)錄因子E47結(jié)合，進(jìn)而形成二聚體。這種二聚體能夠與胰島素基因的E盒高親和力結(jié)合，從而激活胰島素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；因此，NeuroD對(duì)胰腺β細(xì)胞的生理功能有很重要的影響。本試驗(yàn)利用PGMT-NeuroD-3′UTR質(zhì)粒，通過(guò)一次PCR方法使NeuroD-3′UTR上的多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生定點(diǎn)突變，并篩選出突變的目的片段；隨后將突變的片斷連接到螢光素酶報(bào)告載體PGL3-CONTROL上，構(gòu)建了PGL3-3′N(xiāo)euroD突變載體。該結(jié)果可為探討NeuroD基因在胰腺β細(xì)胞發(fā)育中的生理功能，及進(jìn)一步治療糖尿病的研究提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：NeuroD；PCR；突變；載體構(gòu)建；糖尿病

中圖分類(lèi)號(hào)： Q754

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0087-03

糖尿?。╠iabetes mellitus）是一種代謝性疾病，其特征為由于胰島素分泌不足、胰島素功能障礙或兩者同時(shí)存在而導(dǎo)致的，以慢性高血糖并伴有碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂[1]。糖尿病是一種由多種因素導(dǎo)致的疾病，這些因素包括遺傳因素、自身因素（自身免疫）及環(huán)境因素[2]等。

神經(jīng)分化因子1 （NeuroD-1） 是一種bHL H蛋白[3] 。在生物學(xué)中，NeuroD-1又稱(chēng)為β細(xì)胞E盒轉(zhuǎn)錄激活因子2 （Beta-2） 。NeuroD-1/Beta-2對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活/抑制作用主要通過(guò)和靶基因中的特異性序列結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，NeuroD-1/Beta-2也能夠與其他靶基因的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生作用，協(xié)同調(diào)節(jié)靶基因的活性狀態(tài)，進(jìn)而影響相關(guān)基因的生理功能。隨著生物學(xué)的不斷發(fā)展，相關(guān)研究表明NeuroD-1/Beta-2基因發(fā)生突變時(shí)，對(duì)糖尿病的發(fā)生有一定的影響[4]。在利用模式生物小鼠研究NeuroD-1/Beta-2的生物學(xué)功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NeuroD-1/Beta-2 基因缺失時(shí)，小鼠發(fā)生嚴(yán)重的糖尿病，并且這些患有嚴(yán)重糖尿病的小鼠在圍產(chǎn)期發(fā)生死亡。在NeuroD-1/Beta-2基因純合缺失的小鼠中表現(xiàn)的酮尿證實(shí)，這種嚴(yán)重的糖尿病是由于β細(xì)胞功能發(fā)生異常導(dǎo)致的[5]。因此，NeuroD-1/Beta-2 基因?qū)ρ芯恳认侔l(fā)育和糖尿病機(jī)制具有重要的意義。

基因突變技術(shù)常用于研究基因調(diào)控、表達(dá)和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能等，其中，定點(diǎn)突變技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越被生物學(xué)家廣泛應(yīng)用于基因工程、蛋白質(zhì)工程研究。目前使用較廣泛的主要有重組PCR法、重疊延伸法、U模版法和大引物突變法等。其中，重疊延伸的方法和大引物突變的方法均需要多次PCR和多對(duì)引物，才能使得目標(biāo)突變率高，這種方法操作復(fù)雜并且步驟繁瑣?？焖貾CR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變方法僅需1次PCR 反應(yīng)，目標(biāo)突變效率高，操作簡(jiǎn)單，節(jié)約成本[6]。

本試驗(yàn)為了構(gòu)建NeuroD-3′UTR的定點(diǎn)突變，進(jìn)一步研究NeuroD基因與糖尿病之間的生物學(xué)機(jī)制，采用快速PCR定點(diǎn)突變的方法，對(duì)NeuroD-3′UTR同時(shí)進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的突變，并篩選出突變的目的片段，構(gòu)建了PGL3-3′N(xiāo)euroD 突變載體，為探討NeuroD基因在胰腺β細(xì)胞發(fā)育中的生理功能，及進(jìn)一步治療糖尿病的研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PGMT-NeuroD和PGL3-CONTROL載體由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

JM109感受態(tài)細(xì)胞，D2000 Plus DNA ladder購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；1 kb DNA Ladder Marker購(gòu)自于北京艾德萊生物技術(shù)有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ與FseⅠ（NEB公司），T4 DNA連接酶（TaKaRa公司）；DNA凝膠回收試劑盒、快速質(zhì)粒小量提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega公司；瓊脂糖購(gòu)自Biowest公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；PCR引物、質(zhì)粒測(cè)序均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 突變引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NeuroD的編碼序列（GenBank序列號(hào)：gi：226493587）（粗體為突變位點(diǎn)）設(shè)計(jì)上游引物P1，序列為：5′-GAAAAAAAACCAACAAATTCGTCAATTTGAGCAATTCATCT-3′，下游引物P2，序列為：5′-AGATGAATTGCTCAAATTGACGAATTTGTTGGTTTTTTTTC-3′。

1.2.2 快速PCR介導(dǎo)的突變 以PGMT-NeuroD-3′UTR為模板，采用PCR方法使NeuroD-3′UTR發(fā)生多個(gè)位點(diǎn)的定點(diǎn)突變。PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃初始變性5 min，16個(gè)循環(huán)（ 94 ℃ 1 min，58 ℃ 40 s，72 ℃ 5 min），72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 保存。擴(kuò)增片段大小應(yīng)為 3 432 bp，純化PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。

1.2.3 NerouD-3′UTR突變質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 回收產(chǎn)物用DPN1酶消化模版，消化時(shí)間為8 h。消化反應(yīng)體系為：PGMT-NerouD-3′UTR（PCR回收）17.5 μL，10×DNP1 buffer 2 μL，DNP 1 （10 U/μL）1 μL。將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后提取質(zhì)粒，所提質(zhì)粒經(jīng)PCR驗(yàn)證后用XbaⅠ與FseⅠ酶進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，用瓊脂糖凝膠驗(yàn)證突變片段正確后，將獲取的目的DNA 送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。

1.2.4 PGL3-3′UTR載體的構(gòu)建與鑒定 用XbaⅠ與FseⅠ酶分別對(duì)Pgmt-NeuroD-3′UTR和 PGL3-CONTROL進(jìn)行雙酶切處理，1% 瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收相應(yīng)目的DNA和質(zhì)粒酶切片段。DNA片段與酶切的PGL3-CONTROL載體采用T4 DNA 連接酶16 ℃ 過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化后經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證所提質(zhì)粒，XbaⅠ與FseⅠ雙酶切鑒定后，將重組質(zhì)粒命名為PGL3/NeuroD-3′UTR載體。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR介導(dǎo)的PGMT-NeuroD-3′UTR突變

設(shè)計(jì)突變引物P1/P2，以實(shí)驗(yàn)室自存PGMT-NeuroD為模板，采用一次快速PCR方法將PGMT-NeuroD-3′UTR上多個(gè)堿基突變。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物約為3 432 bp左右的DNA條帶且特異性較高，同預(yù)期片段的大小符合（圖1）。

2.2 PCR介導(dǎo)的PGMT-NeuroD-3′UTR突變檢測(cè)

將突變產(chǎn)物經(jīng)DPN1消化后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109中，挑取克隆，通過(guò)菌液PCR檢驗(yàn)克隆的準(zhǔn)確性，將菌液PCR鑒定正確的菌液用質(zhì)粒提取試劑盒提取突變質(zhì)粒，利用引物P1/P2對(duì)所提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物約為417 bp，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，條帶大小符合預(yù)計(jì)（圖2）。

同時(shí)利用XbaⅠ與FseⅠ對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，短片段約417 bp，長(zhǎng)片段3 000 bp左右，符合預(yù)計(jì)大?。▓D3）。

將突變完成的質(zhì)粒送到公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示正確，目標(biāo)位置成功突變，位于1854、1855、1856位置的堿基由TTGCACA變成TTCGTAC，并且沒(méi)有出現(xiàn)其他堿基的突變（圖4）。

2.3 PGL3-NeuroD3′UTR突變載體的構(gòu)建

將表達(dá)載體PGL3-CONTROL與突變完成的質(zhì)粒用XbaⅠ與FseⅠ雙酶切，并膠回收，1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)酶切膠回收結(jié)果，條帶大小符合預(yù)計(jì)（圖5）。連接轉(zhuǎn)化后挑取4 個(gè)單克隆菌落培養(yǎng)過(guò)夜，通過(guò)菌液PCR檢驗(yàn)克隆的準(zhǔn)確性，引物為P1/P2，全長(zhǎng)為417 bp，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，有2個(gè)克隆的條帶大小符合預(yù)計(jì)（圖6）。

將菌液PCR鑒定正確的菌液用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，利用提取的質(zhì)粒，通過(guò)擴(kuò)增引物P1/P2，做質(zhì)粒PCR，條帶位于400～500 bp之間（圖7），符合預(yù)計(jì)大小。同時(shí)利用XbaⅠ與FseⅠ雙酶切檢測(cè)所提取的質(zhì)粒，條帶符合預(yù)計(jì)大?。▓D8），顯示PGL3-NeuroD-3′UTR突變載體構(gòu)建成功。

3 討論

糖尿?。╠iabetes mellitus）是一組由于胰島素分泌不足、胰島素功能障礙或兩者同時(shí)存在而導(dǎo)致的代謝性疾病。其特征為慢性高血糖并伴有碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。糖尿病是一種由多種因素導(dǎo)致的疾病，這些因素包括遺傳因素、自身因素（自身免疫）及環(huán)境因素。NeuroD-1/Beta-2對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活/抑制作用主要通過(guò)和靶基因中的特異性序列結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，NeuroD-1/Beta-2也能夠與其他靶基因的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生作用，協(xié)同調(diào)節(jié)靶基因的活性狀態(tài)，進(jìn)而影響相關(guān)基因的生理功能，調(diào)節(jié)靶基因的最終活性狀態(tài)[7]。前期研究表明NeuroD-1/Beta-2基因發(fā)生突變時(shí)，對(duì)糖尿病的發(fā)生有一定的影響，且Beta-2作為一種轉(zhuǎn)錄因子能夠激活磺脲類(lèi)受體基因1（SUR-1） [8]。在生物體中，β細(xì)胞胰島素的分泌情況受SUR-1的調(diào)節(jié)，這種調(diào)節(jié)機(jī)理主要是NeuroD-1 能夠和SUR-1的E3元件結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)相關(guān)的組織發(fā)生特異性表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)MEK-ERK 信號(hào)通路在葡萄糖刺激下能夠影響NeuroD-1 的活性，NeuroD-1發(fā)生入核，促進(jìn)了胰島素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[9]。因此，NeuroD-1基因?qū)ρ芯亢椭委熖悄虿【哂兄匾囊饬x。

基因突變技術(shù)應(yīng)用很廣泛，這種技術(shù)制備的突變體可用于研究基因的調(diào)控表達(dá)情況、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能[10]。隨著定點(diǎn)突變技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能主要通過(guò)突變體研究來(lái)實(shí)現(xiàn)。寡聚核苷酸引物與靶DNA 雜合分子中間的單個(gè)堿基的錯(cuò)配并不影響擴(kuò)增效率，因此利用引物區(qū)域的錯(cuò)配使PCR 產(chǎn)物定點(diǎn)突變的方法可以導(dǎo)致DNA的定點(diǎn)突變。近年來(lái)，產(chǎn)生了一種新型定點(diǎn)突變的PCR方法，該方法是把需要突變的基因克隆到質(zhì)粒載體上，用2個(gè)突變引物同時(shí)擴(kuò)增質(zhì)粒DNA，用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)模板DNA進(jìn)行消化，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌并篩選陽(yáng)性克隆。由于該方法僅需1次PCR 反應(yīng)，很大程度地降低了反應(yīng)時(shí)間，所以被稱(chēng)為快速PCR法，這種新的PCR方法減少了反應(yīng)中因堿基錯(cuò)配而造成的非特異突變，提高了目標(biāo)突變率。

本試驗(yàn)即根據(jù)上述原理，采用一次快速PCR定點(diǎn)突變方法，對(duì)NeuroD-3′UTR的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，經(jīng)PCR檢測(cè)及測(cè)序鑒定，目標(biāo)位置突變成功，1854、1855、1856位置的堿基由TTGCACA變成TTCGTAC（圖4），測(cè)序結(jié)果顯示，沒(méi)有出現(xiàn)其他堿基的突變，降低了堿基錯(cuò)配的概率，提高了突變效率。隨后將突變片段連接到螢光素酶報(bào)告載體PGL3-CONTROL上，經(jīng)PCR和酶切鑒定，成功構(gòu)建了PGL3-NeuroD-3′UTR突變載體（圖7、圖8），為后續(xù)NeuroD基因的研究，以及通過(guò)該基因?yàn)樘悄虿〉难芯康於嘶A(chǔ)。

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