莖直黃芪中苦馬豆素的提取工藝研究

郝寶成 楊賢鵬 王學(xué)紅 陳慧 郭文柱 郭志廷 劉宇 尚若鋒 胡永浩 梁劍平

摘要：以莖直黃芪（Astragalus strictus）為原料，通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)和方差分析確定了苦馬豆素的酶法提取工藝條件，并用氣相色譜法測定了提取物中苦馬豆素的含量。結(jié)果表明，優(yōu)化后的莖直黃芪中苦馬豆素最佳提取條件為，粉碎目數(shù)80目、料液比1∶40、纖維素酶添加量3.5%、酶解時(shí)間3.0 h。在此提取條件下，苦馬豆素的提取率可達(dá)到39.41 mg/kg。該法快速、高效、方便、節(jié)能，有利于莖直黃芪中苦馬豆素的提取。

關(guān)鍵詞：莖直黃芪（Astragalus strictus）；苦馬豆素；纖維素酶；氣相色譜法

中圖分類號：S567.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）08-1886-03

莖直黃芪（Astragalus strictus）為豆科黃芪屬多年生植物，在西藏各地均有分布，每年在其密集生長的牧區(qū)都有大批的家畜中毒死亡，是中國西藏牧區(qū)危害最嚴(yán)重的毒草之一[1，2]。莖直黃芪中的主要有毒成分為苦馬豆素，是一種大極性的吲哚里西丁類生物堿，水溶性極好，經(jīng)動物腸道吸收后，在溶酶體酸性環(huán)境下解離，因其陽離子結(jié)構(gòu)與Α-甘露糖陽離子結(jié)構(gòu)近似，使得競爭結(jié)合Α-甘露糖甘酶，不僅抑制了Α-甘露糖甘酶酶活性，同時(shí)造成溶酶體內(nèi)甘露糖不能代謝而蓄積，導(dǎo)致細(xì)胞特別是神經(jīng)細(xì)胞的空泡性，從而引起動物中毒[3]?？囫R豆素同時(shí)還具有抗腫瘤活性，能特異性地抑制高爾基氏體Α-甘露糖甘酶Ⅱ的活性，同時(shí)抑制了腫瘤細(xì)胞表面糖蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并能緩解化療和放療中產(chǎn)生的骨髓抑制作用[4]。

目前苦馬豆素的提取主要采用熱回流法、索氏提取法、超聲波提取的常規(guī)醇提法[5]。近年來，酶的用途越來越廣泛，涉及的領(lǐng)域也越來越多，生物酶解提取法是利用酶反應(yīng)的高度專一性，將細(xì)胞壁的水解或者降解，破壞細(xì)胞壁，從而提高有效成分的提取率。目前，中藥提取方面研究較多的酶是纖維素酶[6，7]，大部分中藥材的細(xì)胞壁主要是由纖維素類物質(zhì)構(gòu)成的，植物的有效成分往往包裹在細(xì)胞內(nèi)部，用纖維素酶酶解可以使植物細(xì)胞壁破壞，有利于有效成分的提取。由于酶制劑在常溫、 常壓條件下就能起催化作用， 能有效地提高植物藥中有效成分的含量。目前關(guān)于酶解法提取苦馬豆素鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)為了進(jìn)一步提高苦馬豆素的提取率、降低生產(chǎn)成本，采用纖維素酶對莖直黃芪進(jìn)行酶解提取苦馬豆素， 取得了良好的效果，為酶法提取苦馬豆素提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 莖直黃芪（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院提供）；苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品（購自西安楊凌天力生物技術(shù)有限公司，純度為98.4%）；雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）+三甲基氯硅烷（TMCS）（硅烷化試劑，百靈威公司產(chǎn)品）；纖維素酶（工業(yè)級，140萬活性單位）；甲醇、氯仿、正丁醇、吡啶、D-甘露醇等均為分析純。

1.1.2 儀器 氣相色譜儀（VARIAN CP-3380）；色譜柱為瓦里安毛細(xì)色譜柱CP-SIL5 CB（15M×0.25 mm×0.33 mm）；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-5203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將莖直黃芪自然條件下戶外晾干，粉碎后過40～80目篩，備用。精密稱取適量莖直黃芪干草粉于燒瓶中，加入一定量pH 4.5的酸水，添加一定量的纖維素酶，在50 ℃下進(jìn)行酶解反應(yīng)。反應(yīng)后將提取液煮沸2 min，過濾，濾液濃縮成浸膏，甲醇溶解，過濾，濾液濃縮成浸膏，用堿性正丁醇溶解浸膏，過濾，回收正丁醇，并用吡啶溶解殘留物作為供試樣品，準(zhǔn)確量取吡啶溶液上清液100 μL，分別加入10 μL D-甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和100 μL BSTFA+TMCS（99∶1），室溫條件下干燥器中衍生反應(yīng)1 h。進(jìn)行GC分析，記錄色譜峰面積比較分析。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2 色譜條件 進(jìn)樣口溫度為260 ℃，火焰離子化檢測器（FID）溫度為260 ℃，柱子初始溫度為150 ℃，程序升溫5 ℃/min（8 min），再程序升溫

30 ℃/min（2 min），氣為高純氮?dú)猓魉贋? mL/min，定量方法為內(nèi)標(biāo)工作曲線法。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置 準(zhǔn)確稱取D-甘露醇2 mg，溶于10 mL吡啶中，配成質(zhì)量濃度為0.2 g/L的溶液。準(zhǔn)確稱取1 mg苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品，用吡啶配成質(zhì)量濃度為0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將其分別稀釋為0.05 g/L、0.025 g/L、0.012 5 g/L、0.006 25 g/L、0.003 125 g/L和0.001 562 5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，分別加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液和100 μL BSTFA+TMCS（體積比為99∶1），供GC分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以標(biāo)準(zhǔn)樣品中苦馬豆素的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，以苦馬豆素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出回歸方程y=11.961x-0.004 7，R2=0.999 0。結(jié)果表明，苦馬豆素濃度在0.001 562 5～0.1 g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。圖1為苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。

1.2.5 單因素及正交試驗(yàn) 考察莖直黃芪粉碎目數(shù)、料液比、酶添加量、酶解時(shí)間對苦馬豆素提取率的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上確定正交試驗(yàn)工藝參數(shù)，通過正交試驗(yàn)確立最佳提取工藝條件，表1為正交試驗(yàn)L9（34）的因素和水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 過篩目數(shù)對苦馬豆素提取率的影響

由圖2可知，粉碎后的過篩目數(shù)對苦馬豆素的提取率影響較小，當(dāng)過篩目數(shù)在80目時(shí)，提取率達(dá)到最大值。

2.2 料液比對苦馬豆素提取率的影響

由圖3可知，隨著料液比的增大，苦馬豆素提取率明顯增加，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，提取率達(dá)到較大值，此后再增加料液比，提取率增加不明顯。因此，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，料液比以1∶40為宜。

2.3 酶用添加量對苦馬豆素提取率的影響

由圖4可知，隨著酶添加量的增加，苦馬豆素提取率逐漸提高，當(dāng)酶添加量達(dá)到3.5%時(shí)，提取率基本已達(dá)到最大值，繼續(xù)增加酶添加量，提取率增加不明顯。因此，確定加酶添加量為3.5%。

2.4 酶解時(shí)間對苦馬豆素提取率的影響

由圖5可知，酶解時(shí)間在3.0 h之前，苦馬豆素的提取率隨提取時(shí)間的延長而上升，當(dāng)時(shí)間達(dá)到3.0 h 之后，提取率的增加不明顯，而且時(shí)間過長會延長提取周期。因此，確定酶解時(shí)間為3.0 h。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對提取莖直黃芪中苦馬豆素的莖直黃芪粉碎目數(shù)、料液比、纖維素酶添加量、酶解時(shí)間等因素按表1進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。由表2、3的試驗(yàn)結(jié)果和方差分析可知，各因素影響的主次為D>A>C>B，最佳條件為A3B2C3D2，即正交試驗(yàn)的最佳工藝條件為莖直黃芪粉碎為80目、料液比1∶40、酶添加量為莖直黃芪的3.5%、酶解時(shí)間3 h，按該條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到苦馬豆素的提取率為39.41 mg/kg。

3 小結(jié)與討論

3.1 結(jié)論

試驗(yàn)確定的纖維素酶提取莖直黃芪中苦馬豆素的最佳工藝參數(shù)為：粉碎目數(shù)80目、料液比1∶40、纖維素酶添加量3.5%、酶解時(shí)間3.0 h。其提取條件也溫和，工業(yè)生產(chǎn)易于實(shí)現(xiàn)，為苦馬豆素的提取提供了一種新方法。

3.2 檢測方法

試驗(yàn)采用了GC內(nèi)標(biāo)法對提取物中苦馬豆素進(jìn)行檢測，通過苦馬豆素和內(nèi)標(biāo)物D-甘露糖峰面積之比進(jìn)行計(jì)算，消除了手動進(jìn)樣上產(chǎn)生的誤差，使得結(jié)果更加準(zhǔn)確[8-11]。

3.3 提取方法

由于植物細(xì)胞壁的架構(gòu)物質(zhì)主要為纖維素、果膠等，特別是纖維素對細(xì)胞外壁起到支撐和保護(hù)作用，纖維素酶和果膠酶在提取介質(zhì)中可使纖維素和果膠降解，從而破壞植物細(xì)胞壁，有利于提取成分的溶出。因此纖維素酶和果膠酶可有效地提高苦馬豆素的提取率，本試驗(yàn)僅對纖維素酶進(jìn)行酶降解提取莖直黃芪中苦馬豆素進(jìn)行了研究，下一步將會對纖維素酶和果膠酶的復(fù)合酶提取方法進(jìn)行研究，以提高苦馬豆素的提取率。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙寶玉，樊月圓，樊澤峰，等.我國西部草原瘋草危害及其動物中毒病的控制[J].草食家畜，2006，（1）：12-15.

[2] 李建科.中國瘋草研究現(xiàn)狀與展望[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003， 36（9）：1091-1099.

[3] 郝寶成，梁劍平，楊賢鵬，等.“瘋草”中苦馬豆素解毒制劑及抗腫瘤應(yīng)用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（5）：2664-2665，2668.

[4] 路 浩，王建軍，孫莉莎，等.苦馬豆素抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（9）：87-90.

[5] 趙 俊，童德文，稅媛媛，等. 甘肅棘豆草中苦馬豆素的提取分離工藝比較研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2006，26（7）：1459-1463.

[6] 奚奇輝，李士敏. 纖維素酶在竹葉總黃酮提取中的應(yīng)用[J].中草藥，2004，35（2）：166-167.

[7] 楊軍宣，尹蓉莉，楊 勝，等.纖維素酶在三七提取工藝中的應(yīng)用[J].中國中醫(yī)藥科技，2001，8（5）：3.

[8] 劉忠艷，趙寶玉，孫莉莎，等.苦馬豆素來源及其檢測方法的研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38（2）：175-180.

[9] 宋毓民，王建華，王愛華，等.家兔血清中苦馬豆素的氣相色譜測定方法[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30（3）：402-405.

[10] 王 帥，陳根元，胡建軍，等. 氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定南疆地區(qū)小花棘豆中苦馬豆素含量[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，48（4）：728-733.

[11] 趙興華，何 欣，王建華.氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定苦馬豆素的含量[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（6）：71-74.