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    不同DNA提取試劑盒提取作物種子基因組DNA效果的比較

    2013-04-29 04:34:33李會(huì)任志瑩王穎王建忠
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2013年8期
    關(guān)鍵詞:比較作物

    李會(huì) 任志瑩 王穎 王建忠

    摘要:比較3種不同DNA提取試劑盒(寶生物、天根、LGC)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用效果,分別提取玉米、水稻和大豆種子的基因組DNA。結(jié)果表明,天根DNA提取試劑盒DP305更為適合從作物種子中提取基因組DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測。

    關(guān)鍵詞:DNA提取試劑盒;基因組DNA;作物;比較

    中圖分類號(hào):Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2013)08-1956-03

    隨著轉(zhuǎn)基因作物種類的增多和種植面積的增加[1],轉(zhuǎn)基因種子的應(yīng)用越來越廣泛。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在提高作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)、緩解糧食危機(jī)等方面作出了巨大貢獻(xiàn),然而其安全性方面的不確定因素也帶來了轉(zhuǎn)基因生物安全問題[2,3]。2001年發(fā)布實(shí)施了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》,對(duì)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品實(shí)行安全評(píng)價(jià)制度、生產(chǎn)許可制度、經(jīng)營許可制度和產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度[4,5]。因此,需要對(duì)作物種子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測,而基因組DNA提取作為轉(zhuǎn)基因檢測中的關(guān)鍵步驟,需要穩(wěn)定、重復(fù)性好、簡便快捷的方法進(jìn)行提取。基因組DNA提取的方法有很多[6-8],目前廣泛使用的是商業(yè)化的基因組DNA提取試劑盒[9],常見的DNA提取試劑盒主要分為3類:離心柱型、無毒型(不使用酚氯仿)、磁珠型。

    本研究使用常見的不同DNA提取試劑盒對(duì)玉米、水稻、大豆種子的基因組DNA提取效果進(jìn)行比較,確定了適合轉(zhuǎn)基因檢測使用的DNA提取試劑盒。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2均為農(nóng)業(yè)部發(fā)放的標(biāo)準(zhǔn)品。

    1.2 試劑與儀器

    天根DP305 DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司,寶生物D9093 DNA提取試劑盒購自沈陽聯(lián)星生物技術(shù)公司,LGC41602 DNA提取試劑盒購自北京昊諾斯科技有限公司,PCR反應(yīng)試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。

    5424型高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司,ND2000型DNA定量儀購自美國Thermo公司,C1000型PCR儀及GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司,BG-600k核酸水平電泳系統(tǒng)購自北京百晶生物技術(shù)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 轉(zhuǎn)基因作物基因組DNA的提取 使用3種DNA提取試劑盒分別提取轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)和轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的基因組DNA,操作方法具體見試劑盒說明書。測定其DNA濃度及OD260 nm/OD280 nm。DNA提取率(μg/g)=DNA濃度(ng/μL)×體積(μL)/取材量(g)[5]。

    1.3.2 PCR擴(kuò)增驗(yàn)證 通過擴(kuò)增篩選因子CaMV35S啟動(dòng)子基因來檢測3種DNA試劑盒提取的基因組DNA在轉(zhuǎn)基因成分檢測中的效果,試驗(yàn)重復(fù)3次。PCR擴(kuò)增引物和擴(kuò)增條件[10]見表1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 3種DNA提取試劑盒提取基因組DNA的效果比較結(jié)果

    3種DNA試劑盒所提取的DNA及相關(guān)結(jié)果見表2。從表2中可以看出,LGC DNA試劑盒提取率最高,成本最高;寶生物試劑盒提取率次之,提取時(shí)間也較長,成本也較高;天根試劑盒提取率最低,成本也最低。在操作過程中還發(fā)現(xiàn),LGC試劑盒和寶生物試劑盒的操作步驟比較繁瑣,天根試劑盒的操作最簡便快捷。

    3種DNA提取試劑盒提取的基因組DNA濃度和純度比較見圖1和圖2。從圖1中可以看出,無論是玉米、水稻還是大豆,LGC試劑盒提取的DNA濃度為最高,寶生物和天根試劑盒提取的玉米和水稻的DNA濃度比較接近,但提取的大豆DNA濃度有明顯差異,天根試劑盒提取的較低。從圖2中可以看出,就大豆而言,天根試劑盒提取DNA純度最高,寶生物試劑盒提取的次之,LGC試劑盒提取的最低;就玉米而言,LGC試劑盒提取的DNA純度最高,寶生物試劑盒提取DNA純度次之,天根試劑盒提取的最低;就水稻而言,LGC試劑盒提取的DNA純度最高,天根試劑盒提取DNA純度次之,寶生物試劑盒提取的最低。

    2.2 3種DNA試劑盒提取基因組DNA的PCR驗(yàn)證結(jié)果分析

    使用3種DNA試劑盒分別提取的玉米、水稻、大豆種子的基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng),擴(kuò)增CaMV35S啟動(dòng)子基因結(jié)果如圖3。從圖3中可以看出,在均取1 μL DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)的情況下,PCR反應(yīng)擴(kuò)增CaMV35S啟動(dòng)子來檢測提取的DNA,寶生物和天根試劑盒的圖譜較清晰,LGC試劑盒效果較差。

    3 小結(jié)與討論

    天根試劑盒采用的是離心柱法,DNA損耗量較大,但是對(duì)于日常檢測提取的樣品是足夠使用的。由于其對(duì)樣品需求量小、耗時(shí)短、操作簡單、成本低、純度好,在日常檢測中應(yīng)用較廣。寶生物試劑盒在樣品使用量上較大,水浴時(shí)間也較長,操作步驟較天根試劑盒更為繁瑣一些。英國LGC類型屬于磁珠型,試劑盒內(nèi)包含一個(gè)小的磁力架(可放置2個(gè)1.5 mL離心管),過程中不使用酚和氯仿,操作中不需要高速離心,提取的DNA濃度較高,但成本也較高。綜上所述,天根DNA提取試劑盒DP305較適合從作物種子中提取基因組DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測。

    參考文獻(xiàn):

    [1] JAMES C. 2009 年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢——第一個(gè)十四年(1996-2009)[J].中國生物工程雜志,2010,30(2):1-22.

    [2] 周萍入, 齊振宏. 消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因食品健康風(fēng)險(xiǎn)與生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)認(rèn)知實(shí)證研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(社會(huì)科學(xué)版),2012(1):5-10.

    [3] 王桂才. 轉(zhuǎn)基因食品的安全性評(píng)價(jià)及檢測技術(shù)進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā),2012,33(5):220-221.

    [4] 宋貴文,李飛武,張 明,等.我國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全檢測機(jī)構(gòu)體系運(yùn)行現(xiàn)狀分析[J].農(nóng)業(yè)科技管理,2011,30(1):40-43.

    [5] 王明遠(yuǎn). 轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管模式及我國轉(zhuǎn)基因生物安全立法研究[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版),2007,25(2):169-172.

    [6] GB/T 19495.3-2004,轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 核酸提取純化方法[S].

    [7] ZHANG F L, LIU Y, SONG J, et al. A method for rapid salt-extraction of high-quality genomic DNA from plant seeds[J]. Agricultural Science & Technology-Hunan,2012,13(3):485-488.

    [8] 莊 蓉,郭瓊霞,黃可輝,等.菟絲子屬5個(gè)種的種子DNA微量提取方法比較[J].植物檢疫,2008,22(4):216-219.

    [9] 趙梅珍,劉 暉,賀莉芳,等.三種試劑盒提取糞便隱孢子蟲微量 DNA 的效果比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(26):16130-16131.

    [10] 農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,上海交通大學(xué),等.農(nóng)業(yè)部953號(hào)公告-6-2007轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因水稻定性PCR方法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2007.1-6.

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