小菜蛾p38MAPK基因的克隆與生物信息學分析

胡霞 谷希樹 劉曉琳等

摘要：小菜蛾（Plutella xylostella L）是一種危害十字花科植物的世界性害蟲，研究其基因功能為尋找新的小菜蛾防治方法具有重要意義。本研究克隆了小菜蛾p38 MAPK基因的開放閱讀框（ORF），并根據(jù)其DNA序列推導出了蛋白一級結構，發(fā)現(xiàn)該基因編碼一個含有349個氨基酸殘基的蛋白。通過SMART網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)該蛋白在第20～304位氨基酸殘基區(qū)域存在著一個典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域，說明它是一個潛在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Blast比對發(fā)現(xiàn)Pxp38基因與家蠶Bmp38基因、釀酒酵母ScHOG1基因、人類Homo sapiens p38 基因在蛋白一級結構上的相似性分別是917%、516%和786%，說明p38 MAPK基因在進化上具有較高的保守性。

關鍵詞：小菜蛾；p38基因；MAPK；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；生物信息學分析

中圖分類號：Q785：Q969.42+5.2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）08-0015-04

小菜蛾（Plutella xylostella L）屬鱗翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），其分布范圍廣，繁殖能力強，主要取食十字花科植物，嚴重危害蔬菜生產(chǎn)_[1，2]。由于小菜蛾的抗藥性發(fā)展十分迅速，因此，尋找新的防治方法已經(jīng)變得十分迫切_[3，4]。為了更好地實現(xiàn)小菜蛾的防治，需要更多地了解小菜蛾的基因尤其是耐藥基因及響應外界刺激相關基因的生物學功能_[5～7]。2012年福建農林大學的尤民生教授等_[7]領導的國際合作小組第一次完成了小菜蛾的全基因組序列圖譜的繪制，這為小菜蛾基因功能的研究以及發(fā)展新的防治手段揭開了新的篇章，具有重要意義。本研究就是在小菜蛾全基因組測序的基礎上完成的。

蛋白質在細胞內發(fā)揮生物學功能經(jīng)常需要磷酸化和去磷酸化修飾，細胞中具有磷酸化修飾功能的酶是蛋白激酶_[8]。MAPK（Mitogen-activated protein kinase）是一類典型的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，在真菌、植物和動物等各種真核生物細胞內保守存在。它可以通過三層蛋白激酶級聯(lián)系統(tǒng)，響應外界環(huán)境各種脅迫刺激，起始細胞內多種信號傳導途徑，具有重要的生物學功能_{[9，10]}。人類細胞中的MAPK包括p38、Erk1、Erk2和JNK等_{[11，12]}。

本研究克隆了小菜蛾的Pxp38基因，根據(jù)其基因序列推導出蛋白質一級結構，分析預測了該蛋白質的結構域，并研究了該基因與家蠶Bmp38基因、釀酒酵母ScHOG1基因、人類Homo sapiens p38 基因之間的同源性，為下一步深入研究Pxp38基因的功能奠定了基礎。

1材料與方法11供試昆蟲

本實驗所用小菜蛾為天津市植物保護研究所室內飼養(yǎng)的敏感種群，用無蟲甘藍苗繼代飼養(yǎng)20代以上，取四齡幼蟲供試。

1.2主要試劑

Trizol和SuperScript cDNA合成試劑盒購自Invitrogen公司；Taq酶、dNTPs、pMD18-T載體和Ecoli DH5α感受態(tài)細胞購自TaKaRa公司；限制性內切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ購自NEB公司；DNA純化回收試劑盒、瓊脂糖、蛋白胨、氨芐青霉素、X-gal、IPTG、DEPC和質粒小提試劑盒等購自北京天根生化科技公司。

1.3引物設計

根據(jù)小菜蛾基因組數(shù)據(jù)庫DBM-DB（Diamondback moth Genome Database）_[7]提供的Px015291基因序列，在其開放閱讀框（ORF）兩側各設計一條引物，由Invitrogen公司合成。上游引物Pxp38-F：5′-ATGCCGAGGTATCACAAAGTGG-3′，下游引物Pxp38-R：5′-CTACCTATAGTTCGGGGTCG-3′。

1.4小菜蛾總RNA的提取、cDNA第一鏈合成和PCR條件

取小菜蛾幼蟲100 mg，液氮冷凍研磨后，用Trizol法提取小菜蛾總RNA，具體步驟參照Invitrogen公司的Trizol試劑說明書，最后溶解于 30 μl DEPC水中，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，將其直接用于RT-PCR或-80℃保存。

取1 μg總RNA，參照Invitrogen公司的SuperScript cDNA合成試劑盒說明書，以Oligo（dT）18作為逆轉錄引物合成cDNA第一鏈。逆轉錄反應設置實驗組和對照組，實驗組加逆轉錄酶，對照組不加逆轉錄酶。

以實驗組和對照組逆轉錄產(chǎn)物為模板，使用引物Pxp38-F和Pxp38-R進行PCR反應，反應條件為：94℃ 5 min； 94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.5重組質粒pMD18T-Pxp38 ORF的構建與鑒定

將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化回收試劑盒回收，取100 ng與25 ng pMD18-T載體16℃下連接4 h。將連接產(chǎn)物轉化Ecoli DH5α感受態(tài)細胞，在LB+Amp平板上通過藍白斑篩選轉化子，挑取3個白斑轉化子接種到液體LB+Amp培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。使用質粒小提試劑盒提取重組質粒，利用限制性內切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ對其進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

1.6生物信息學分析

利用Chromas軟件分析DNA測序結果；通過Vector NTI軟件根據(jù)p38 ORF序列推導蛋白質一級結構；通過SMART網(wǎng)站（http：//smartembl-heidelbergde/）分析預測小菜蛾Pxp38蛋白結構域；利用Blast軟件比較不同物種間p38蛋白一級結構的同源性；小菜蛾基因組數(shù)據(jù)庫DBM-DB的網(wǎng)址是http：//wwwiaefafueducn/dbm/。

2結果與分析

2.1Pxp38基因ORF的獲得

利用引物Pxp38-F和Pxp38-R克隆Pxp38基因的ORF片段，結果如圖1所示，實驗組得到了大小約1 kb的單一DNA條帶，對照組只得到了非特異性雜帶，說明成功獲得了Pxp38基因的ORF片段。

3討論 本研究首次克隆了小菜蛾的Pxp38 MAPK基因，并對其進行了生物信息學分析，揭示出Pxp38基因是一個潛在的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，從最簡單的真核模式生物釀酒酵母到高等哺乳動物人類的細胞中都保守存在。本研究為進一步深入探討Pxp38 MAPK基因的功能，揭示小菜蛾響應外界脅迫以及產(chǎn)生藥物耐受的分子機制提供了基礎，為開辟小菜蛾防治新途徑提供參考。

參考文獻：

[1]Talekar N S， Shelton A M Biology， ecology， and management of the diamondback moth [J] Annu Rev Entomol ， 1993， 38： 275-301

[2]Furlong M J， Wright D J， Dosdall L M Diamondback moth ecology and management： problems， progress， and prospects [J] Annu Rev Entomol ， 2013， 58： 517-541

[3]Tabashnik B E， Huang F， Ghimire M N， et al Efficacy of genetically modified Bt toxins against insects with different genetic mechanisms of resistance [J] Nat Biotechnol， 2011，29（12）：1128-1131

[4]Baxter S W， Badenes-Pérez F R， Morrison A， et al Parallel evolution of Bacillus thuringiensis toxin resistance in lepidoptera [J] Genomics， 2011， 189（2）： 675-679

[5]He W， You M， Vasseur L， et al Developmental and insecticide-resistant insights from the de novo assembled transcriptome of the diamondback moth， Plutella xylostella [J] Genomics， 2012， 99（3）： 169-177

[6]Li X， Schuler M A， Berenbaum M R Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics[J] Annu Rev Entomol ， 2007， 52： 231-253

[7]You M， Yue Z， He W， et al A heterozygous moth genome provides insights into herbivory and detoxification [J] Nat Genet ， 2013， 45（2）： 220-225

[8]Manning G， Whyte D B， Martinez R， et al The protein kinase complement of the human genome [J] Science， 2002， 298（5600）： 1912-1934

[9]Gustin M C， Albertyn J， Alexander M， et al MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae [J] Microbiol Mol Biol Rev ， 1998， 62（4）： 1264-1300

[10]Rodriguez M C， Petersen M， Mundy J Mitogen-activated protein kinase signaling in plants [J] Annu Rev Plant Biol ， 2010， 61： 621-649

[11]Pearson G， Robinson F， Beers Gibson T， et al Mitogen-activated protein （MAP） kinase pathways： regulation and physiological functions [J] Endocr Rev ， 2001， 22 （2）： 153-183

[12]Theodosiou A， Ashworth A MAP kinase phosphatases [J] Genome Biol ， 2002， 3（7）： REVIEWS3009