陸地棉GhNIP5.1基因的電子克隆及生物信息學(xué)分析

鞏元勇， 郭書巧， 束紅梅， 何林池， 倪萬潮

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，農(nóng)業(yè)部長江下游棉花和油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014;2.江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 如皋 226541)

水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是古老的通道蛋白MIP(Membrane intrinsic protein)家族成員之一，是廣泛存在于動植物和微生物中，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)水分子和某些小分子物質(zhì)的一類膜嵌入式蛋白。1992年，第一個植物水通道蛋白從擬南芥中分離獲得，由于其定位在液泡膜，因此被命名為液泡膜內(nèi)在蛋白(TIP)［1］。近年來，在玉米、棉花、水稻、油菜、向日葵等多種植物中都發(fā)現(xiàn)有AQPs的存在，且在植物不同發(fā)育時期的不同組織和器官中廣泛分布［2］。與其他類型的生物相比，植物AQPs類型更為豐富，多樣性也更大［3］。根據(jù)植物體AQPs的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞定位的不同分為4種類型，液泡膜內(nèi)在蛋白、質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIP)、大豆根廇菌周膜上水通道蛋白類NOD26膜內(nèi)在蛋白(NIP)以及定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜上的小分子堿性膜內(nèi)在蛋白(SIP)［4-6］。植物AQPs不僅具有水分子運(yùn)輸功能，還具有某些營養(yǎng)元素(硅、硼等)［5-7］和某些中性小分子(甘油、尿素、甲酰胺等)［8］的運(yùn)輸功能，在植物細(xì)胞水分平衡的維持和生長發(fā)育等生理過程中具有舉足輕重的作用。

利用生物信息學(xué)同源性搜索和分子克隆，在陸地棉(Gossypium hirsutum)中發(fā)現(xiàn)存在71 個 AQPs［9］。但是絕大多數(shù)的棉花AQPs還沒有克隆獲得全長序列，對它們的生理及分子功能的理解更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。本試驗(yàn)通過電子克隆的方法，獲得棉花GhNIP5.1基因全長的開放閱讀框序列，并在棉花基因組測序結(jié)果中，搜索獲得了GhNIP5.1基因的編碼區(qū)序列，對所獲得的序列進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)的預(yù)測和分析，以期為進(jìn)一步深入研究該基因的功能提供必要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 棉花GhNIP5.1基因的電子克隆

根據(jù)同源基因中存在保守序列的特性，用擬南芥AtNIP5.1基因(NCBI登錄號:NM_117106)序列為信息探針，對NCBI中EST數(shù)據(jù)庫棉花(Gossypium hirsutum)進(jìn)行Tblastx同源性檢索，將檢索到的來自于棉花的EST序列利用DNAS-tar軟件拼接獲得連接體。然后用此連接體再次同源檢索、拼接，重復(fù)以上過程直至無棉花的重疊EST檢出，最終獲得陸地棉GhNIP5.1基因的cDNA序列片段。再以此片段在NCBI中進(jìn)行Blastx同源性檢索，與其他物種的水通道蛋白進(jìn)行序列比較，進(jìn)而判斷拼接得到的陸地棉GhNIP5.1基因的cDNA的正確性及其ORF序列的完整性。然后用DNAS-tar軟件分析該序列，并將ORF翻譯成氨基酸序列。

1.2 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)預(yù)測與分析

用ProtParam對蛋白質(zhì)進(jìn)行基本特性分析;利用SOPMA軟件對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的組成形式進(jìn)行分析;用TMHMM-2.0預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域;用NCBI的 Blast P對氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)保守區(qū)分析;用NetPhos 2.0 Server預(yù)測蛋白質(zhì)翻譯后的磷酸化修飾位點(diǎn);用PSORT進(jìn)行信號肽及亞細(xì)胞定位分析。

1.3 氨基酸序列同源和進(jìn)化分析

用DNAMAN V6軟件對棉花GhNIP5.1蛋白的氨基酸序列和擬南芥AtNIP家族蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建同源樹;用MEGA4軟件，采用Neighbor-Joining法對NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的其他植物NIP5.1蛋白和棉花Gh-NIP5.1蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.4 基因結(jié)構(gòu)分析

棉花D亞組雷蒙德式棉(Gossypium raimondii)基因組DNA已經(jīng)測序并部分公布(http://www.phytozome.net/cotton.php)，根據(jù)獲得的 GhNIP5.1基因的 ORF序列，在已公布的棉花基因組序列中搜尋 GhNIP5.1基因序列，通過DNAStar軟件分析GhNIP5.1基因的外顯子和內(nèi)含子的大小及分布情況。

2 結(jié)果

2.1 棉花GhNIP5.1基因的電子克隆結(jié)果

利用擬南芥AtNIP5.1(GenBank登錄號:NM_117106)基因序列為種子序列，在棉花EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Tblastx同源性檢索，得到56條長度不一的棉花EST序列，將這些EST序列拼接獲得連接體，將這個連接體再次在棉花EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Tblastx同源性檢索，將獲得的EST序列再次拼接;重復(fù)以上過程，直到序列不能再延伸為止，最終獲得1條長度為1 303 bp的cDNA序列。DNAStar軟件分析發(fā)現(xiàn)，該序列包含1個897 bp的ORF，翻譯后的氨基酸序列有298個氨基酸殘基構(gòu)成，與擬南芥AtNIP5.1蛋白氨基酸序列一致性達(dá)到83.2%，將該序列命名為GhNIP5.1。

2.2 棉花GhNIP5.1蛋白基本特性分析

由GhNIP5.1基因的cDNA序列推測GhNIP5.1蛋白由298個氨基酸殘基構(gòu)成，利用ProtParam分析該蛋白的基本理化性質(zhì)，結(jié)果表明，GhNIP6.1成熟蛋白質(zhì)的分子量是30 970，理論等電點(diǎn)為8.57;該蛋白質(zhì)含 Ala(A)最多，占13.8%，不含有Pyl(O)和Sec(U)，負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)是16，正電荷的氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)是19;脂肪系數(shù)為91.97，表明其為脂溶性蛋白;總平均親水性為0.410，該蛋白屬于疏水性蛋白;不穩(wěn)定系數(shù)是31.36，表明該蛋白是穩(wěn)定蛋白。

2.3 棉花GhNIP5.1蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA在線分析GhNIP5.1蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，該成熟蛋白質(zhì)主要由α-螺旋、延伸直鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲4種結(jié)構(gòu)形式構(gòu)成。這4種結(jié)構(gòu)的氨基酸組成及占全部氨基酸的比例分別為:α-螺旋包含105個氨基酸，約占35.23%;延伸直鏈包含49個氨基酸，約占16.44%;β-轉(zhuǎn)角包含9個氨基酸，約占3.02%;無規(guī)則卷曲包含135個氨基酸，約占45.30%?？梢姡瑹o規(guī)則卷曲區(qū)間是該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要組成部分。

2.4 棉花GhNIP5.1氨基酸序列跨膜結(jié)構(gòu)及保守區(qū)預(yù)測

用TMHMM-2.0對GhNIP5.1蛋白氨基酸序列跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果顯示，該成熟蛋白質(zhì)具有5個跨膜螺旋(TM1～TM5)，由4個環(huán)相連，其中蛋白質(zhì)的N末端和環(huán)B、D都在細(xì)胞膜外，C末端和環(huán)A、C位于細(xì)胞膜內(nèi)，N末端有73個氨基酸，C末端有18個氨基酸。用Blast P在NCBI的蛋白質(zhì)保守區(qū)數(shù)據(jù)庫對GhNIP5.1氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該氨基酸序列的65～227位區(qū)段與MIP超家族相匹配，具有MIP家族典型的NPA(Asp-Pro-Ala基序)保守肽段和兩親性通道，由此推測該基因是水通道蛋白基因家族的一員。

2.5 棉花GhNIP5.1蛋白翻譯后修飾預(yù)測

用NetPhos 2.0 Server預(yù)測GhNIP5.1蛋白翻譯后修飾的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果表明，32、34、39、99、160、185 和295 位的7 個Ser(絲氨酸)，6、8、19、147、246 位的5 個 Thr(蘇氨酸)和35 位的Tyr(色氨酸)可能發(fā)生翻譯后的磷酸化修飾。由PSORT軟件預(yù)測信號肽及亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，GhNIP5.1的氨基酸序列沒有信號肽殘基，該蛋白質(zhì)最有可能定位在質(zhì)膜上。

2.6 棉花GhNIP5.1蛋白的進(jìn)化樹和同源樹分析

棉花GhNIP5.1蛋白的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫已公布的NIP5.1蛋白的擬南芥(Arabidopsis thaliana，登錄號:NP_192776)、大豆(Glycin max，登錄號:XP_003535560)、蓮花(Lotus japonicus，登錄號:ABY19373)、葡萄(Vitis vinifera，登錄號:XP_002276319)和玉米(Zea mays，登錄號:NP_001150784)的氨基酸序列的一致性分別為83.2%、74.8%、71.1%、89.3%和42.7%。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，棉花與葡萄聚到一個分支，進(jìn)化關(guān)系最近，與玉米的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.7 棉花GhNIP5.1基因結(jié)構(gòu)分析

在棉花基因組中搜尋GhNIP5.1基因，結(jié)果表明，該基因編碼區(qū)全長2 067 bp，包含4個外顯子和3個內(nèi)含子，所有內(nèi)含子的左右邊界均為gt/ag結(jié)構(gòu)。通過對比發(fā)現(xiàn)，棉花Gh-NIP5.1基因與擬南芥AtNIP5.1基因內(nèi)含子和外顯子數(shù)量均相同，這兩個基因只有第一個外顯子長度存在18 bp的微小差異，其他3個外顯子長度均相當(dāng)，造成基因結(jié)構(gòu)差異的主要原因是內(nèi)含子長度不同，尤其是第一個內(nèi)含子有1 159 bp的長度差。

3 討論

用擬南芥AtNIP5.1(GenBank登錄號:NP_192776)的蛋白質(zhì)序列在 HMMER(http://hmmer.janelia.org/)中進(jìn)行同源檢索，結(jié)果顯示棉花中與之同源的序列有52條，其中與之同源性最高的是已公布的棉花NIP6.1(GenBank登錄號:DAA33875)的部分片段序列，但是在這些序列中并沒有GhNIP5.1的信息，由此表明，GhNIP5.1基因還沒有被克隆。

表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tags，EST)是在來源于不同組織的cDNA文庫中隨機(jī)克隆，對所挑選的克隆進(jìn)行單向測序后獲得的cDNA序列，長度一般在300～500 bp［10］?；虻碾娮涌寺【褪且訣ST數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，運(yùn)用計(jì)算機(jī)分析技術(shù)進(jìn)行新基因克隆的一種方法。通過生物信息學(xué)的方式向EST序列延伸，最終獲得新基因的部分或全長cDNA序列［11］。起初，隨著人類與小鼠、牛、線蟲和斑馬魚等多種模式生物的全基因組測序的完成，電子克隆作為克隆基因的新方法在模式生物上的應(yīng)用相對比較廣泛［12］。隨著各種測序工作的開展，尤其是EST數(shù)據(jù)庫的不斷擴(kuò)大和充實(shí)，電子克隆在小麥［13］、棉花［14］、大豆［15］和油菜［16］等植物新基因的獲取中都有應(yīng)用。

AQPs是通道蛋白MIP家族成員之一，具有MIP家族結(jié)構(gòu)的典型特征，最主要的是在其α-螺旋結(jié)構(gòu)中包含有3個氨基酸殘基(Asp-Pro-Ala基序)構(gòu)成的NPA模體，參與形成AQP水孔［5］。在GhNIP5.1氨基酸序列中就存在這個 NPA保守肽段，初步推斷它是屬于MIP家族成員的AQPs。磷酸化是植物AQPs水通道活性非常重要的調(diào)控方式，通過磷酸化，可以快速、直接、可逆地實(shí)現(xiàn)植物 AQP的門控調(diào)節(jié)［6］。預(yù)測GhNIP5.1蛋白存在有13個可能發(fā)生翻譯后修飾的磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的存在可能參與該水通道蛋白對水分或其他物質(zhì)運(yùn)輸?shù)幕钚哉{(diào)節(jié)。這些結(jié)果提示該基因可能在棉花水分調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有著重要意義，為進(jìn)一步深入探索該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

與棉花GhNIP5.1氨基酸序列一致性最高的是葡萄和擬南芥，分別達(dá)到89.3%和83.2%。擬南芥NIP家族與棉花GhNIP5.1 同源性最高的是 AtNIP5.1，由此推斷 GhNIP5.1 和AtNIP5.1可能具有類似的生理學(xué)功能。AtNIP5.1是擬南芥根部主要的硼酸通道蛋白，對擬南芥在缺硼條件下根系對硼的有效吸收以及植株正常的生長發(fā)育至關(guān)重要［7］。那么，棉花GhNIP5.1是否也與AtNIP5.1一樣是硼酸通道蛋白呢?還需要深入研究。

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