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      陸地棉GhNIP5.1基因的電子克隆及生物信息學(xué)分析

      2013-04-18 05:10:45鞏元勇郭書巧束紅梅何林池倪萬潮
      江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報 2013年3期
      關(guān)鍵詞:登錄號擬南芥克隆

      鞏元勇, 郭書巧, 束紅梅, 何林池, 倪萬潮

      (1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,農(nóng)業(yè)部長江下游棉花和油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014;2.江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 如皋 226541)

      水通道蛋白(Aquaporin,AQP)是古老的通道蛋白MIP(Membrane intrinsic protein)家族成員之一,是廣泛存在于動植物和微生物中,負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)水分子和某些小分子物質(zhì)的一類膜嵌入式蛋白。1992年,第一個植物水通道蛋白從擬南芥中分離獲得,由于其定位在液泡膜,因此被命名為液泡膜內(nèi)在蛋白(TIP)[1]。近年來,在玉米、棉花、水稻、油菜、向日葵等多種植物中都發(fā)現(xiàn)有AQPs的存在,且在植物不同發(fā)育時期的不同組織和器官中廣泛分布[2]。與其他類型的生物相比,植物AQPs類型更為豐富,多樣性也更大[3]。根據(jù)植物體AQPs的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞定位的不同分為4種類型,液泡膜內(nèi)在蛋白、質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIP)、大豆根廇菌周膜上水通道蛋白類NOD26膜內(nèi)在蛋白(NIP)以及定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜上的小分子堿性膜內(nèi)在蛋白(SIP)[4-6]。植物AQPs不僅具有水分子運(yùn)輸功能,還具有某些營養(yǎng)元素(硅、硼等)[5-7]和某些中性小分子(甘油、尿素、甲酰胺等)[8]的運(yùn)輸功能,在植物細(xì)胞水分平衡的維持和生長發(fā)育等生理過程中具有舉足輕重的作用。

      利用生物信息學(xué)同源性搜索和分子克隆,在陸地棉(Gossypium hirsutum)中發(fā)現(xiàn)存在71 個 AQPs[9]。但是絕大多數(shù)的棉花AQPs還沒有克隆獲得全長序列,對它們的生理及分子功能的理解更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。本試驗(yàn)通過電子克隆的方法,獲得棉花GhNIP5.1基因全長的開放閱讀框序列,并在棉花基因組測序結(jié)果中,搜索獲得了GhNIP5.1基因的編碼區(qū)序列,對所獲得的序列進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)的預(yù)測和分析,以期為進(jìn)一步深入研究該基因的功能提供必要的基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 棉花GhNIP5.1基因的電子克隆

      根據(jù)同源基因中存在保守序列的特性,用擬南芥AtNIP5.1基因(NCBI登錄號:NM_117106)序列為信息探針,對NCBI中EST數(shù)據(jù)庫棉花(Gossypium hirsutum)進(jìn)行Tblastx同源性檢索,將檢索到的來自于棉花的EST序列利用DNAS-tar軟件拼接獲得連接體。然后用此連接體再次同源檢索、拼接,重復(fù)以上過程直至無棉花的重疊EST檢出,最終獲得陸地棉GhNIP5.1基因的cDNA序列片段。再以此片段在NCBI中進(jìn)行Blastx同源性檢索,與其他物種的水通道蛋白進(jìn)行序列比較,進(jìn)而判斷拼接得到的陸地棉GhNIP5.1基因的cDNA的正確性及其ORF序列的完整性。然后用DNAS-tar軟件分析該序列,并將ORF翻譯成氨基酸序列。

      1.2 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)預(yù)測與分析

      用ProtParam對蛋白質(zhì)進(jìn)行基本特性分析;利用SOPMA軟件對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的組成形式進(jìn)行分析;用TMHMM-2.0預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域;用NCBI的 Blast P對氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)保守區(qū)分析;用NetPhos 2.0 Server預(yù)測蛋白質(zhì)翻譯后的磷酸化修飾位點(diǎn);用PSORT進(jìn)行信號肽及亞細(xì)胞定位分析。

      1.3 氨基酸序列同源和進(jìn)化分析

      用DNAMAN V6軟件對棉花GhNIP5.1蛋白的氨基酸序列和擬南芥AtNIP家族蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析,并構(gòu)建同源樹;用MEGA4軟件,采用Neighbor-Joining法對NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的其他植物NIP5.1蛋白和棉花Gh-NIP5.1蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹。

      1.4 基因結(jié)構(gòu)分析

      棉花D亞組雷蒙德式棉(Gossypium raimondii)基因組DNA已經(jīng)測序并部分公布(http://www.phytozome.net/cotton.php),根據(jù)獲得的 GhNIP5.1基因的 ORF序列,在已公布的棉花基因組序列中搜尋 GhNIP5.1基因序列,通過DNAStar軟件分析GhNIP5.1基因的外顯子和內(nèi)含子的大小及分布情況。

      2 結(jié)果

      2.1 棉花GhNIP5.1基因的電子克隆結(jié)果

      利用擬南芥AtNIP5.1(GenBank登錄號:NM_117106)基因序列為種子序列,在棉花EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Tblastx同源性檢索,得到56條長度不一的棉花EST序列,將這些EST序列拼接獲得連接體,將這個連接體再次在棉花EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Tblastx同源性檢索,將獲得的EST序列再次拼接;重復(fù)以上過程,直到序列不能再延伸為止,最終獲得1條長度為1 303 bp的cDNA序列。DNAStar軟件分析發(fā)現(xiàn),該序列包含1個897 bp的ORF,翻譯后的氨基酸序列有298個氨基酸殘基構(gòu)成,與擬南芥AtNIP5.1蛋白氨基酸序列一致性達(dá)到83.2%,將該序列命名為GhNIP5.1。

      2.2 棉花GhNIP5.1蛋白基本特性分析

      由GhNIP5.1基因的cDNA序列推測GhNIP5.1蛋白由298個氨基酸殘基構(gòu)成,利用ProtParam分析該蛋白的基本理化性質(zhì),結(jié)果表明,GhNIP6.1成熟蛋白質(zhì)的分子量是30 970,理論等電點(diǎn)為8.57;該蛋白質(zhì)含 Ala(A)最多,占13.8%,不含有Pyl(O)和Sec(U),負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)是16,正電荷的氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)是19;脂肪系數(shù)為91.97,表明其為脂溶性蛋白;總平均親水性為0.410,該蛋白屬于疏水性蛋白;不穩(wěn)定系數(shù)是31.36,表明該蛋白是穩(wěn)定蛋白。

      2.3 棉花GhNIP5.1蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

      利用SOPMA在線分析GhNIP5.1蛋白的二級結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,該成熟蛋白質(zhì)主要由α-螺旋、延伸直鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲4種結(jié)構(gòu)形式構(gòu)成。這4種結(jié)構(gòu)的氨基酸組成及占全部氨基酸的比例分別為:α-螺旋包含105個氨基酸,約占35.23%;延伸直鏈包含49個氨基酸,約占16.44%;β-轉(zhuǎn)角包含9個氨基酸,約占3.02%;無規(guī)則卷曲包含135個氨基酸,約占45.30%??梢姡瑹o規(guī)則卷曲區(qū)間是該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要組成部分。

      2.4 棉花GhNIP5.1氨基酸序列跨膜結(jié)構(gòu)及保守區(qū)預(yù)測

      用TMHMM-2.0對GhNIP5.1蛋白氨基酸序列跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測,結(jié)果顯示,該成熟蛋白質(zhì)具有5個跨膜螺旋(TM1~TM5),由4個環(huán)相連,其中蛋白質(zhì)的N末端和環(huán)B、D都在細(xì)胞膜外,C末端和環(huán)A、C位于細(xì)胞膜內(nèi),N末端有73個氨基酸,C末端有18個氨基酸。用Blast P在NCBI的蛋白質(zhì)保守區(qū)數(shù)據(jù)庫對GhNIP5.1氨基酸序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,該氨基酸序列的65~227位區(qū)段與MIP超家族相匹配,具有MIP家族典型的NPA(Asp-Pro-Ala基序)保守肽段和兩親性通道,由此推測該基因是水通道蛋白基因家族的一員。

      2.5 棉花GhNIP5.1蛋白翻譯后修飾預(yù)測

      用NetPhos 2.0 Server預(yù)測GhNIP5.1蛋白翻譯后修飾的磷酸化位點(diǎn),結(jié)果表明,32、34、39、99、160、185 和295 位的7 個Ser(絲氨酸),6、8、19、147、246 位的5 個 Thr(蘇氨酸)和35 位的Tyr(色氨酸)可能發(fā)生翻譯后的磷酸化修飾。由PSORT軟件預(yù)測信號肽及亞細(xì)胞定位,結(jié)果表明,GhNIP5.1的氨基酸序列沒有信號肽殘基,該蛋白質(zhì)最有可能定位在質(zhì)膜上。

      2.6 棉花GhNIP5.1蛋白的進(jìn)化樹和同源樹分析

      棉花GhNIP5.1蛋白的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫已公布的NIP5.1蛋白的擬南芥(Arabidopsis thaliana,登錄號:NP_192776)、大豆(Glycin max,登錄號:XP_003535560)、蓮花(Lotus japonicus,登錄號:ABY19373)、葡萄(Vitis vinifera,登錄號:XP_002276319)和玉米(Zea mays,登錄號:NP_001150784)的氨基酸序列的一致性分別為83.2%、74.8%、71.1%、89.3%和42.7%。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,棉花與葡萄聚到一個分支,進(jìn)化關(guān)系最近,與玉米的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

      2.7 棉花GhNIP5.1基因結(jié)構(gòu)分析

      在棉花基因組中搜尋GhNIP5.1基因,結(jié)果表明,該基因編碼區(qū)全長2 067 bp,包含4個外顯子和3個內(nèi)含子,所有內(nèi)含子的左右邊界均為gt/ag結(jié)構(gòu)。通過對比發(fā)現(xiàn),棉花Gh-NIP5.1基因與擬南芥AtNIP5.1基因內(nèi)含子和外顯子數(shù)量均相同,這兩個基因只有第一個外顯子長度存在18 bp的微小差異,其他3個外顯子長度均相當(dāng),造成基因結(jié)構(gòu)差異的主要原因是內(nèi)含子長度不同,尤其是第一個內(nèi)含子有1 159 bp的長度差。

      3 討論

      用擬南芥AtNIP5.1(GenBank登錄號:NP_192776)的蛋白質(zhì)序列在 HMMER(http://hmmer.janelia.org/)中進(jìn)行同源檢索,結(jié)果顯示棉花中與之同源的序列有52條,其中與之同源性最高的是已公布的棉花NIP6.1(GenBank登錄號:DAA33875)的部分片段序列,但是在這些序列中并沒有GhNIP5.1的信息,由此表明,GhNIP5.1基因還沒有被克隆。

      表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tags,EST)是在來源于不同組織的cDNA文庫中隨機(jī)克隆,對所挑選的克隆進(jìn)行單向測序后獲得的cDNA序列,長度一般在300~500 bp[10]?;虻碾娮涌寺【褪且訣ST數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ),運(yùn)用計(jì)算機(jī)分析技術(shù)進(jìn)行新基因克隆的一種方法。通過生物信息學(xué)的方式向EST序列延伸,最終獲得新基因的部分或全長cDNA序列[11]。起初,隨著人類與小鼠、牛、線蟲和斑馬魚等多種模式生物的全基因組測序的完成,電子克隆作為克隆基因的新方法在模式生物上的應(yīng)用相對比較廣泛[12]。隨著各種測序工作的開展,尤其是EST數(shù)據(jù)庫的不斷擴(kuò)大和充實(shí),電子克隆在小麥[13]、棉花[14]、大豆[15]和油菜[16]等植物新基因的獲取中都有應(yīng)用。

      AQPs是通道蛋白MIP家族成員之一,具有MIP家族結(jié)構(gòu)的典型特征,最主要的是在其α-螺旋結(jié)構(gòu)中包含有3個氨基酸殘基(Asp-Pro-Ala基序)構(gòu)成的NPA模體,參與形成AQP水孔[5]。在GhNIP5.1氨基酸序列中就存在這個 NPA保守肽段,初步推斷它是屬于MIP家族成員的AQPs。磷酸化是植物AQPs水通道活性非常重要的調(diào)控方式,通過磷酸化,可以快速、直接、可逆地實(shí)現(xiàn)植物 AQP的門控調(diào)節(jié)[6]。預(yù)測GhNIP5.1蛋白存在有13個可能發(fā)生翻譯后修飾的磷酸化位點(diǎn),這些位點(diǎn)的存在可能參與該水通道蛋白對水分或其他物質(zhì)運(yùn)輸?shù)幕钚哉{(diào)節(jié)。這些結(jié)果提示該基因可能在棉花水分調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有著重要意義,為進(jìn)一步深入探索該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

      與棉花GhNIP5.1氨基酸序列一致性最高的是葡萄和擬南芥,分別達(dá)到89.3%和83.2%。擬南芥NIP家族與棉花GhNIP5.1 同源性最高的是 AtNIP5.1,由此推斷 GhNIP5.1 和AtNIP5.1可能具有類似的生理學(xué)功能。AtNIP5.1是擬南芥根部主要的硼酸通道蛋白,對擬南芥在缺硼條件下根系對硼的有效吸收以及植株正常的生長發(fā)育至關(guān)重要[7]。那么,棉花GhNIP5.1是否也與AtNIP5.1一樣是硼酸通道蛋白呢?還需要深入研究。

      [1]H?FTE H,HUBBARD L,REIZER J,et a1.Vegetative and seed-specific forms of tonoplast intrinsic protein in the vacuolar membrane of Arabidopsis thaliana[J].Plant Physiology,1992,99(2):561-570.

      [2]BAIGE I,Schaffner A R,Affenzeller M J,et al.Plant aquaporins[J].Physiologia Plantarum,2002,115(2):175-182.

      [3]KALDENHOF R,F(xiàn)ISCHER M.Aquaporins in plants[J].Acta Physiologica,2006,187:169-176.

      [4]CHAUMONT F,BARRIEU F,WOJCIK E,et al.Aquaporins constitute a large and highly divergent protein family in maize[J].Plant Physiology,2001,125(3):1206-1215.

      [5]QUIGLEY F,ROSENBERG J M,SHACHAR -HILL Y,et al.From genome to function:the Arabidopsis aquaporins[J].Genome Biology,2001,3(1):1-17.

      [6]CHANMONT F,MOSHELION M,DANIELS M J.Regulation of plant aquaporin activity[J].Biology Cell,2005,97(10):749-764.

      [7]TAKANO J,WADA M,LUDEWIG U,et al.The Arabidopsis major intrinsic protein NIP5.1 is essential for efficient boron uptake and plant development under boron limitation[J].Plant Cell,2006,18(6):1498-1509.

      [8]MAUREL C,VERDOUCQ L,LUU D T,et al.Plant aquaporins:memberane channels with multiple integrated functions[J].Annual Review of Plant Biology,2008,59:595-624.

      [9]PARK W,Scheffler B E,Bauer P J,et al.Identification of the family of aquaporin genes and their expression in upland cotton(Gossypium hirsutum L.)[J].BMC Plant Biology,2010,10:142-158.

      [10]萬海偉,杜立新.表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)在基因組學(xué)研究中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報,2004,20(1):35-39.

      [11]王冬冬,朱延明,李 勇,等.電子克隆技術(shù)及其在植物基因工程中的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,37(3):403-408.

      [12]胡 皝,蕭浪濤.生物信息學(xué)在新基因全長cDNA電子克隆中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報,2007(4):93-96.

      [13]張龍雨,袁 蕾,楊書玲,等.小麥雄性不育系中TaPDC-E1及其調(diào)節(jié)酶基因的表達(dá)特征[J].作物學(xué)報,2011,37(4):620-628.

      [14]童旭宏,吳玉香,祝水金.陸地棉EPSPS基因的克隆及其組織特異性表達(dá)分析[J].棉花學(xué)報,2009,21(4):259-264.

      [15]姜 威,朱寶華,高靜瑤,等.大豆天冬氨酸途徑關(guān)鍵酶基因GmASADH的克隆與分析[J].中國油料作物學(xué)報,2011,33(3):221-225.

      [16]薛 蕾,閆貴欣,高桂珍,等.白菜型油菜八氫番茄紅素合酶基因BrPSY的克隆與序列分析[J].中國油料作物學(xué)報,2011,33(3):210-215.

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