利用分子標(biāo)記鑒定四川省馬鈴薯品種

唐銘霞，何衛(wèi)，胡建軍，王克秀，王余明，劉冬

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，四川成都610066）

利用分子標(biāo)記鑒定四川省馬鈴薯品種

唐銘霞，何衛(wèi)*，胡建軍，王克秀，王余明，劉冬

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，四川成都610066）

以15個(gè)馬鈴薯育成品種和引進(jìn)品種為材料，采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)鑒定供試馬鈴薯品種。研究檢測(cè)了4個(gè)SSR位點(diǎn)在15份馬鈴薯育成品種（系）中的多態(tài)性。在15份馬鈴薯品種（系）中，共檢測(cè)到等位基因26個(gè)，每對(duì)引物檢測(cè)到的等位基因個(gè)數(shù)最少為5個(gè)，最多為10個(gè)，平均6.5個(gè)。PIC（Polymorphism information content）值最高為0.9288；最低為0.8597，平均PIC值為0.8857。僅利用少數(shù)幾對(duì)高PIC值的SSR引物，即能將全部供試品種（系）區(qū)分，因此，SSR技術(shù)有利于高效準(zhǔn)確的鑒定馬鈴薯品種。

SSR；馬鈴薯；品種鑒定

隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對(duì)育種提出了更高的要求。在育種實(shí)踐中，傳統(tǒng)鑒定方法主要采取形態(tài)比較，但由于受環(huán)境及主觀因素的影響而效率較低。另外，由于現(xiàn)代育種研究中的新品種多由數(shù)量有限的一些優(yōu)良品種作親本雜交育成，新品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，品種之間的形態(tài)學(xué)差異越來越小，造成可供品種鑒定利用的形態(tài)性狀不足，增加了品種鑒定的困難。分子標(biāo)記反應(yīng)DNA水平遺傳差異，與傳統(tǒng)鑒定方法相比，在種質(zhì)資源的鑒定、評(píng)價(jià)以及種質(zhì)資源遺傳多樣性分析等方面具有較大優(yōu)越性。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)目前已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用，它的一個(gè)重要潛在應(yīng)用領(lǐng)域是品種鑒定和品種產(chǎn)權(quán)保護(hù)。新品種獲得品種權(quán)的重要前提是具備特異性，即明顯不同于同一物種內(nèi)的所有其他品種。為便于品種間的比較，要求測(cè)試數(shù)據(jù)易于保存、處理和交流。目前SSR標(biāo)記在國外已應(yīng)用于部分農(nóng)作物的品種產(chǎn)權(quán)保護(hù)。

研究采用SSR分子標(biāo)記法進(jìn)行馬鈴薯品種鑒定，有效解決馬鈴薯品種混雜和品種鑒定等問題，對(duì)于馬鈴薯生產(chǎn)、加工、育種、常規(guī)檢驗(yàn)以及種質(zhì)資源保護(hù)等都具有非常重要的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 驗(yàn)試材料

供試材料來源于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的15個(gè)栽培品種，見表1。

表1 15份馬鈴薯材料的名稱與來源Table 1 The name and origin of 15 potato cultivars

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取

DNA提取采用改良CTAB法提取馬鈴薯新鮮葉片總DNA。稀釋到20~100 ng/μL，并置于4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2 SSR基本程序擴(kuò)增反應(yīng)的試劑與儀器

使用Eppendorf PCR儀，Taq酶和dNTPs購于TAKARA生物產(chǎn)品有限公司。

根據(jù)徐敏[1]研究結(jié)果，反應(yīng)總體積為20 μL：模板DNA 50 ng，20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，4.0 mmol/L MgCl2，400 μmol/L dNTPs，0.8 μmol/L引物，Taq DNA聚合酶1 U，用雙蒸水調(diào)整終體積至20μL，最后加15μL石蠟油覆蓋。

反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性2 min，然后94℃變性30 s，Tm復(fù)性45 s，72℃延伸45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸10 min，緩慢冷卻至4℃下保存。引物共4對(duì)[2,3]，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR結(jié)束后，在6%聚丙烯酰胺變性凝膠上電泳，凝膠電泳在北京六一的DYY10C型電泳儀上進(jìn)行。電泳結(jié)束后，將膠板用銀染法顯影。

1.2.3 多態(tài)性信息量的計(jì)算

按照Anderson等[4]的方法。參照Harker等[5]，對(duì)于同一SSR引物擴(kuò)增出幾個(gè)片段且位點(diǎn)個(gè)數(shù)不明的情況，仍作為一個(gè)位點(diǎn)計(jì)算，無效等位基因（Null allele）作為一個(gè)等位基因，根據(jù)Smith等[6]的公式計(jì)算多態(tài)性信息量（Polymorphism information content, PIC），即PIC=1-Σfi2，其中f為i位點(diǎn)的基因頻率。采用Nei和Li[7]的方法計(jì)算遺傳相似系數(shù)：GS=2Nxy/ (Nx+Ny)，式中Nx代表x的總帶數(shù)，Ny代表y的總帶數(shù)，Nxy為兩個(gè)體x、y共有的條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

從170對(duì)SSR引物中篩選出4對(duì)多態(tài)性較高、分辨率較高、帶型清楚的引物。其引物序號(hào)分別為STM1052，StI002，StI012和StI057。表2為篩選出的4對(duì)引物。為評(píng)價(jià)不同引物的品種鑒別力，計(jì)算了4對(duì)引物的PIC值，以StI057最高，為0.9288；其次StI012，為0.8896；最低的是STM1052，為0.8597（表2）。4對(duì)引物的平均PIC值為0.8857。

表2 試驗(yàn)所用SSR引物Table 2 SSR primers used in this experiment

2.2 品種區(qū)分鑒定

利用4對(duì)引物對(duì)15份馬鈴薯品種進(jìn)行擴(kuò)增，所有品種均能擴(kuò)增通過SSR引物擴(kuò)增出的譜帶，可以將全部供試馬鈴薯品種區(qū)分開。例如：引物StI012可以完全區(qū)分15個(gè)樣品中的6個(gè)樣品，而引物STM1052可以將引物StI012區(qū)分不開的四組完全區(qū)分開來，StI002和StI057組合也可完全區(qū)分所有供試品種。15個(gè)樣品遺傳相似度見表3。

表3 15個(gè)樣品遺傳相似度Table 3 Genetic similarity of 15 samples

3 討論

分子標(biāo)記技術(shù)作為一種新的品種資源鑒定技術(shù)要應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際,應(yīng)該滿足穩(wěn)定性好、分辨率高、多態(tài)性強(qiáng)、效率高和方便快捷。SSR標(biāo)記是繼RAPD標(biāo)記后出現(xiàn)的基于PCR反應(yīng)的DNA標(biāo)記技術(shù)，SSR標(biāo)記結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，因此SSR反應(yīng)體系利于在實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行交流[8]。

利用SSR技術(shù)進(jìn)行品種鑒定的方法是穩(wěn)定可靠的。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，SSR技術(shù)將在DNA水平上鑒別不同品種是否存在差異,從而科學(xué)、準(zhǔn)確地判斷特定品種的特異性、一致性和穩(wěn)定性，為保護(hù)育種、鑒定和檢測(cè)馬鈴薯品種真實(shí)性提供客觀、科學(xué)和準(zhǔn)確的技術(shù)保障。

四川作為馬鈴薯栽培重要省份,長(zhǎng)期栽培馴化，已經(jīng)培育出很多新品種。本研究將四川省引種和培育的馬鈴薯品種進(jìn)行鑒定區(qū)分。結(jié)果表明，僅利用幾個(gè)高PIC值的SSR位點(diǎn)，就能夠?qū)⑴c試驗(yàn)的全部品種區(qū)分。在馬鈴薯育種中，品種的選育集中在產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆、抗病等性狀上，這使得部分與上述性狀連鎖的SSR位點(diǎn)多態(tài)性大大降低。但在馬鈴薯基因組中仍存在著大量與上述性狀未發(fā)生連鎖或者連鎖不緊密的SSR位點(diǎn)，利用這部分SSR位點(diǎn)的多態(tài)性則可以將選育的品種區(qū)分。因此，利用SSR標(biāo)記高效準(zhǔn)確的進(jìn)行馬鈴薯品種鑒定是完全可行的。

[1]徐敏.中國馬鈴薯審定品種系譜分析及遺傳多樣性研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2007.

[2]Ghislain M,Spooner D M,Rodriguez F,et al.Selection of highly informative and user-friendly microsatellites(SSRs)for genotyping ofcultivated potato[J].Theor ApplGenet,2004,108:881-890.

[3]Feingold S,Lloyd J,Norero N,et al.Mapping and characterization of new EST-derived mirosatellitesforpotato(Solanum tuberosum L.)[J]. Theor Appl Genet,2005,111:456-466.

[4]Anderson JA，ChurchillGA,Autrique JE,etal.Optimizing parental selection for genetic linkage maps[J].Genome,1993,36:181-168.

[5]Harker N,Rampling L R,Shariflou M R,et al.Microsatellites as markers for Australian wheat improvement[J].Aust J Agric Res, 2001,52:1121-1130.

[6]Smith JS C,Chin E CL,Shu H,etal.An evaluation ofthe utility ofSSR loci as molecular markers in maize(Zea mays L.):comparisons with data from RFLPS and pedigree[J].Theoretical and Applied Genetics, 1997,95:163-173.

[7]Nei M,Li W.Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1979,76(10):5269-5273.

[8]匡猛,楊偉華,許紅霞,等.分子標(biāo)記技術(shù)在棉花品種鑒定上的研究進(jìn)展[J],棉花學(xué)報(bào),2009,21(4):330-334.

Identification of Different Potato Cultivars(Solanum tuberosum L.) in Sichuan Province with Molecular Markers

TANG Mingxia,HE Wei＊,HU Jianjun,WANG Kexiu,WANG Yuming,LIU Dong
(Crop Research Institute,Sichuan Academy of Agriculture Sciences,Chengdu,Sichuan 610066,China)

Fifteenpotato cultivars(lines)wereidentifiedusing microsatellitemolecularmarkertechnology.Polymorphismof fourSSRlociin the fifteen potato cultivars(lines)was examined in this research.In the fifteen potato cultivars(lines),26 alleles in total were detected,ranging from 5 to 10 per set of primer pairs,with an average of 6.5.The polymorphism information content (PIC)value of SSR loci varied from the lowest of 0.8597 to the highest of 0.9288,averaging 0.8857.A few SSR primers of high PIC value could distinguish all cultivars in this research.Therefore,SSR technology could be used to identify potato cultivars (lines)efficiently.

SSR;Solanum tuberosum;cultivar identification

S532

A

1672－3635（2013）01-0006-03

2012－12－31

四川省馬鈴薯育種攻關(guān)項(xiàng)目（2011NZ0098－4）。

唐銘霞（1982-），女，助理研究員，主要從事馬鈴薯生物技術(shù)及組培研究。

何衛(wèi)，主要從事馬鈴薯栽培生理生態(tài)和抗病遺傳育種等研究，Email：hewei2008@yahoo.com.cn。