鈣網(wǎng)蛋白免疫調(diào)節(jié)的分子機(jī)制研究

吳薇 劉朝奇

（三峽大學(xué)分子研究所，宜昌 443002）

鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin，CRT）是一種在結(jié)構(gòu)和功能上高度保守的鈣結(jié)合蛋白，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）［1]。大量研究發(fā)現(xiàn)，鈣網(wǎng)蛋白具有多種功能，參與抗原提呈、分子伴侶、抑制血管生成及細(xì)胞黏附等生物學(xué)作用。因此，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性。但鈣網(wǎng)蛋白免疫調(diào)節(jié)作用分子機(jī)制的研究甚少，因此本研究從鈣網(wǎng)蛋白在免疫調(diào)節(jié)增強(qiáng)及免疫逃避方面對其分子機(jī)制進(jìn)行綜述，并期望能為這一領(lǐng)域的科研工作者提供一些參考。

1 CRT的免疫增強(qiáng)活性

1.1 CRT與吞噬作用

機(jī)體對凋亡細(xì)胞的清除是正常的基本的生理功能，這個過程對于維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。目前，比較明確的凋亡細(xì)胞膜上的受體識別配體是磷脂酰絲氨酸（phosPhatidylserine，PS），PS的外翻表明細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，CRT也參與巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的清除過程［2]，CRT與人精子蛋白（ERP57）共轉(zhuǎn)位至膜表面會引起免疫原性的細(xì)胞死亡［3]，主要是通過囊泡相關(guān)膜蛋白（SNARE）依賴的胞吐作用轉(zhuǎn)位至膜表面，這個過程可能與囊泡相關(guān)的SNARE蛋白（如囊泡相關(guān)膜蛋白1）和膜相關(guān)SNARE蛋白（如突觸小體相關(guān)蛋白23/25）的相關(guān)［4]。

凋亡細(xì)胞表面CRT將會促進(jìn)吞噬細(xì)胞的識別及吞噬作用，用siRNA技術(shù)將CRT基因沉默后會抑制吞噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬作用［5]。誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生將會活化絲氨酸-蘇氨酸激酶蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）信號路線，主要表現(xiàn)為Ca2+離子的外流伴隨著PERK980位蘇氨酸的磷酸化，后者會導(dǎo)致真核起始轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2a（eIF2α）的磷酸化（51位蘇氨酸），接著進(jìn)入凋亡前期并伴一些凋亡相關(guān)因子活化，如半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-8（caspase 8），bcl-2相關(guān)蛋白X（bcl-2-associated protein X，Bax）［6，7]。以上研究均突出了CRT在吞噬作用中的重要性。

在用藥物誘導(dǎo)CRT的膜轉(zhuǎn)位時，蒽環(huán)類相比較其他細(xì)胞毒性制劑如奧沙利鉑、順鉑，可以誘導(dǎo)免疫原性的腫瘤細(xì)胞死亡，即蒽環(huán)類藥物可以引起細(xì)胞死亡并刺激機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)而增強(qiáng)治療效果，主要機(jī)制是活化PERK依賴的eIF2α磷酸化信號途徑引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的鈣網(wǎng)蛋白膜轉(zhuǎn)位至細(xì)胞表面［8]。PERK，caspase-8或者SNAREs的基因敲除對蒽環(huán)類誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡沒有影響，但破壞了凋亡細(xì)胞的免疫原性，加入外源性的鈣網(wǎng)蛋白可恢復(fù)其免疫原性［6]。

1.2 抗原提呈

主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）在抗原提呈過程中發(fā)揮主要作用。一些研究發(fā)現(xiàn)［9]，CRT 具有廣泛的連接蛋白質(zhì)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)特定序列糖基化多肽的能力，抗原多肽會被TAP聯(lián)合gp96、CRT或PDI 轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，而CRT 能與 MHC-I類分子A1區(qū)天冬酰胺連接的多聚糖結(jié)合，在 MHC-I 分子的折疊和組裝過程中起作用［10]。MHC-I 類分子/抗原復(fù)合物由 CRT、TAP、tapasin，以及 MHC-I 類分子重鏈 β-2 微球蛋白（β-2m）共同組成，其中，CRT 發(fā)揮相關(guān)運(yùn)載體功能，它利用抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)子（TAP-1，TAP-2）將多肽轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并組裝到新生 MHC-I 類分子上，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗原提呈功能［11]。

應(yīng)用基因敲除 CRT的K42 細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，CRTP區(qū)能抑制MHC-I類分子的表達(dá)，還能正常結(jié)合β2微球蛋白，但運(yùn)載抗原肽的能力下降，外源性表達(dá)CRT 恢復(fù)該細(xì)胞抗原肽運(yùn)載能力［12]。用從小鼠腫瘤細(xì)胞中分離的抗原肽/CRT 復(fù)合物免疫小鼠，觀察到小鼠脾細(xì)胞活化，產(chǎn)生了特異性CD8 T細(xì)胞及有效的抗同種腫瘤免疫應(yīng)答，單獨(dú)使用CRT或抗原肽免疫小鼠未能誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)［13]?？乖恼_的組裝到MHC-I 類分子重鏈 β2微球蛋白（β2m）對于MHC-I類分子的功能和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性很重要。

1.3 CRT在細(xì)胞表面的結(jié)合配體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

蒽環(huán)類藥物誘導(dǎo)鈣網(wǎng)蛋白、熱休克蛋白70和90快速膜轉(zhuǎn)位至細(xì)胞表面，在處理12 h后高遷移率族蛋白B1（HMGB1）釋放，使未成熟樹突狀細(xì)胞與免疫原性腫瘤細(xì)胞的相互作用，在對腫瘤細(xì)胞的攝取增多的同時也促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟。被殺傷的腫瘤細(xì)胞負(fù)載到樹突狀細(xì)胞上能有效地刺激產(chǎn)生腫瘤特異性的γ干擾素，從而刺激T細(xì)胞的增值，減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生［14]。

細(xì)胞表面相關(guān)CRT蛋白在缺少跨膜區(qū)時并沒有一個明顯的信號調(diào)節(jié)機(jī)制，或者細(xì)胞表面的CRT是以糖基化和GPI結(jié)合形式存在的［15]。迄今為止，除了LRP1/CD91，并沒有其他的信號受體被證明能通過從外源性增加細(xì)胞表面CRT來介導(dǎo)細(xì)胞外信號。在測定不同的CRT功能時（如在體內(nèi)傷口愈合試驗(yàn)中通過外源性的增加CRT蛋白可以明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移和增殖）是否依賴LRP1信號通路或者發(fā)現(xiàn)其他穿膜細(xì)胞表面結(jié)合配體。有研究發(fā)現(xiàn)，在沒有LRP1的情況下CRT參與細(xì)胞表面的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能是CRT可以通過細(xì)胞表面的碳水化合物類分子的募集來發(fā)出信號，包括蛋白聚糖類的糖苷鍵通過它的凝集素樣結(jié)合而活化［16]。

與TSP1相似，在人外周血單核細(xì)胞的表面的多功能信號免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞表面蛋白CD69分子與CRT的N端片段可能調(diào)節(jié)包括黏附在內(nèi)的一些功能［17]。細(xì)胞表面的CRT通過自身發(fā)出信號的可能性不太大，但也并不能排除這種可能性［18]。然而，鑒于CRT具有多功能活性，很有可能是非信號蛋白的結(jié)合或者聚集，這種結(jié)合和聚集的機(jī)制是通過結(jié)合或者修飾其他細(xì)胞表面的跨膜分子來調(diào)節(jié)信號。

Holoshitz［19]研究也指出細(xì)胞表面鈣網(wǎng)蛋白可以作為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎共享表位的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體。鈣網(wǎng)蛋白上的共享表位結(jié)合位點(diǎn)位于其P區(qū)第217-223氨基酸殘基，在和樹突狀細(xì)胞相互作用后，共同表位活化有效免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)。在能高表達(dá)細(xì)胞表面鈣網(wǎng)蛋白的CD8陽性樹突狀細(xì)胞中，共同表位能抑制耐受性酶吲哚胺2，3二氧化酶并伴隨著調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化的合成抑制；在CD8陰性的樹突狀細(xì)胞中，共享表位配體會增加IL-6和IL-23的分泌，并且能刺激Th17的產(chǎn)生，Th17細(xì)胞是與自身免疫相關(guān)的T細(xì)胞亞型。鈣網(wǎng)蛋白是通過與共享表位結(jié)合來活化Th17細(xì)胞分化信號，所以在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中細(xì)胞表面鈣網(wǎng)蛋白可能是一種致病原。

2 CRT與免疫逃避

寄生蟲在感染宿主其分泌物扮演著各種角色，包括感染的建立、結(jié)合免疫相關(guān)因子保護(hù)寄生蟲避免宿主免疫系統(tǒng)攻擊及組織滲透等，其中之一便是CRT。在多種寄生蟲感染，如捻轉(zhuǎn)胃蟲、克魯斯錐蟲中都發(fā)現(xiàn)有CRT的身影。隨著研究的進(jìn)一步深入，其作用也慢慢為眾多的研究者所知。

寄生蟲感染宿主主要有兩大策略，一是抗凝血作用；二是結(jié)合某些免疫相關(guān)因子來起到保護(hù)并且避免宿主免疫系統(tǒng)攻擊的作用。在寄生蟲感染時，作為一種抗感染免疫機(jī)制，宿主的紅細(xì)胞會向寄生蟲及其分泌物存在的部位聚集而發(fā)揮包裹作用。然而細(xì)胞的移動及黏附是鈣依賴的，所以寄生蟲會通過分泌CRT來擾亂血細(xì)胞對自身的包裹作用［20]。研究顯示，寄生蟲在分泌的CRT同時還會與宿主體內(nèi)的補(bǔ)體結(jié)合蛋白C1q和C反應(yīng)蛋白（CRP）結(jié)合抑制經(jīng)典補(bǔ)體活化途徑，因?yàn)镃RP和C1q的結(jié)合將會活化經(jīng)典途徑，CRT不僅和C1q結(jié)合，同時還結(jié)合CRP起到了雙重抑制作用［21]。在人源鈣網(wǎng)蛋白研究中，除了已鑒定的補(bǔ)體蛋白C1q結(jié)合位點(diǎn)，在H的N區(qū)還存在著兩個結(jié)合位點(diǎn)，雖然具體的機(jī)制還不是很清楚，但這種具有多個補(bǔ)體蛋白C1q結(jié)合位點(diǎn)與宿主寄生蟲相互作用是有密切聯(lián)系的［22]。

3 結(jié)語

近年來，隨著鈣網(wǎng)蛋白免疫調(diào)節(jié)研究的深入，對于闡明多種疾病的發(fā)生發(fā)展及相關(guān)治療措施將會有巨大的推進(jìn)作用。我們及其他研究團(tuán)隊(duì)都發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上的CRT具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬活性，因此期望通過CRT基因與其他腫瘤靶向基因，如與腫瘤細(xì)胞膜上PD-L1結(jié)合的PD-1嵌合，構(gòu)建獲得融合蛋白達(dá)到靶向免疫治療的目的。這種方式是借助機(jī)體自身的免疫力而非傳統(tǒng)藥物治療，尤其是可以避免腫瘤治療中放化療所帶來的各種副作用。但是目前大部分關(guān)于CRT免疫治療的研究都停留在細(xì)胞、動物水平上，離臨床治療應(yīng)用還有一段距離。如在人體運(yùn)用的安全性問題；獲得的融合蛋白純度；以及大規(guī)模生產(chǎn)的運(yùn)輸和保存等問題。

目前，應(yīng)在保證這種基因治療臨床運(yùn)用的安全性的大前提下，盡可能更多地了解CRT免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制，以及和其他基因構(gòu)建獲得的融合蛋白與機(jī)體相互作用的方式。隨著研究的深入，CRT作為一種免疫治療方式的前景將會更加廣闊。

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