發(fā)酵法生產(chǎn)還原型谷胱甘肽的研究進(jìn)展

趙紅玲，高 楊，尹志峰，王良友△，寇 成

(1.承德醫(yī)學(xué)院中藥所，河北承德 067000;2.承德民族師范學(xué)院)

發(fā)酵法生產(chǎn)還原型谷胱甘肽的研究進(jìn)展

趙紅玲1，高 楊1，尹志峰1，王良友1△，寇 成2

(1.承德醫(yī)學(xué)院中藥所，河北承德 067000;2.承德民族師范學(xué)院)

谷胱甘肽;發(fā)酵法;發(fā)酵調(diào)控過程

谷胱甘肽(Glutathione，簡稱GSH)是由谷氨酸半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的具有多種重要生理功能的活性三肽。由于其廣泛的生物效應(yīng)，臨床上除應(yīng)用于肝臟疾病治療外，還應(yīng)用于惡性腫瘤、神經(jīng)、泌尿、消化等多種疾病的治療。GSH作為一種細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)代謝劑和抗氧化劑，已成為多種疾病特別是危重癥救治中重要的治療和輔助治療藥物。GSH是非酶性抗氧化劑，是細(xì)胞合成的抗氧化劑，對細(xì)胞內(nèi)自發(fā)或酶促反應(yīng)所產(chǎn)生的活性中間產(chǎn)物可清除、解毒，從而在活體細(xì)胞抗氧化物作用中起重要保護(hù)作用[1]。

1 谷胱甘肽的生產(chǎn)方法

國內(nèi)外生產(chǎn)谷胱甘肽的方法有萃取法、化學(xué)合成法、化學(xué)生物合成法、發(fā)酵法、酶法。

1.1 萃取法 GSH的早期生產(chǎn)采用萃取法，一般的工藝流程為:提取-鹽析-離子交換(或膜分離)-濃縮-結(jié)晶。但GSH在動植物體內(nèi)含量較低，有機(jī)溶劑污染嚴(yán)重、純度不高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

1.2 酶法 酶催化合成GSH條件:氨基酸原料(L-Glu、L-Cys和Gly)、ATP、保 持GSHI和GSH II活 性、輔 因 子(Mg2+)和一個(gè)適當(dāng)?shù)膒H值環(huán)境。合成中需求大量ATP，給GSH的工業(yè)化生產(chǎn)帶來麻煩。

1.3 化學(xué)合成法 化學(xué)合成法生產(chǎn)谷胱甘肽是將L-Glu、L-Cys和Gly經(jīng)過基團(tuán)保護(hù)、縮合、脫保護(hù)步驟合成GSH。雖然工藝比較成熟，但合成GSH是消旋體，需要進(jìn)行光學(xué)拆分，因此，限制了該方法的廣泛應(yīng)用。

1.4 化學(xué)生物合成法 以γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)為催化劑，以L-谷氨酰胺作為γ-谷氨?；w，S-芐基-半胱氨酰甘氨酸作為γ-谷氨?；荏w，進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)肽反應(yīng)合成S-芐基-谷胱甘肽。S-芐基-谷胱甘肽脫去芐基得谷胱甘肽，該方法有望開辟一條制備谷胱甘肽的新路線[2]。

1.5 發(fā)酵法 利用微生物代謝將廉價(jià)原料轉(zhuǎn)化為GSH，具有明顯的優(yōu)勢。發(fā)酵使用的細(xì)菌或酵母容易培養(yǎng)，原料容易獲得，操作簡單，反應(yīng)條件溫和，因此，發(fā)酵法已成為目前生產(chǎn)GSH最普遍的方法。

2 發(fā)酵法生產(chǎn)GSH

2.1 生產(chǎn)菌株的選育 發(fā)酵生產(chǎn)GSH所用菌種中釀酒酵母最為常見，相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道也最多。酵母細(xì)胞中GSH的合成及分解代謝過程已被研究清楚，但酵母細(xì)胞的GSH含量較低，存在酵母用量大、收率低等缺點(diǎn)，因此，選育高產(chǎn)GSH的優(yōu)良菌株十分重要。

2.1.1 常規(guī)誘變育種:普通的野生型酵母細(xì)胞中GSH的含量并不高，只有采用物理的或化學(xué)的方法使出發(fā)菌株發(fā)生變異，再在特定的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)，使GSH在這種變異菌株的細(xì)胞內(nèi)大量積累，以此實(shí)現(xiàn)GSH的高產(chǎn)。國內(nèi)外已有許多相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，誘變效果較為顯著的方法和結(jié)果見表1。

表1 高產(chǎn)谷胱甘肽菌株的選育方法和結(jié)果

2.1.2 基因工程技術(shù):80年代以來，隨著基因工程的發(fā)展，將基因工程技術(shù)手段運(yùn)用于高產(chǎn)GSH的菌株的構(gòu)建和菌株代謝調(diào)控方面，為獲得高產(chǎn)菌株拓展了思路。國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中的方法和結(jié)果見表2。

表2 基因工程菌的構(gòu)建和產(chǎn)量

其中，沈繼朵等[14]人將γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)和GSHⅡ基因分別構(gòu)建不同的質(zhì)粒中，用宿主E．coli BL21表達(dá)，GSH產(chǎn)量0.524g/L，此方法成為生產(chǎn)GSH的一條新路線。

2.2 優(yōu)化發(fā)酵工藝 為了進(jìn)一步提高GSH的產(chǎn)量，優(yōu)化培養(yǎng)條件，以實(shí)現(xiàn)生物量和胞內(nèi)GSH大幅度積累。

2.2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化:微生物的生長所需的碳、氮源和無機(jī)鹽、微量元素對于生物量的累計(jì)和目標(biāo)產(chǎn)物的生成十分關(guān)鍵，有人將先進(jìn)的數(shù)學(xué)模型運(yùn)用到優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中。卞芙蓉[15]等應(yīng)用Plackett Burman設(shè)計(jì)，對酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的培養(yǎng)基10個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，選擇出顯著因素葡萄糖、酵母膏和半胱氨酸，然后用球面對稱設(shè)計(jì)對這3個(gè)因素各取5個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化。在優(yōu)化條件下，發(fā)酵液中谷胱甘肽積累量可達(dá)162.3mg/L，比優(yōu)化前產(chǎn)量提高約56.2%。魯延迅等[16]人利用谷胱甘肽的總產(chǎn)量與細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)關(guān)系，通過添加底物Gly、Glu和高滲刺激物KCI促進(jìn)谷胱甘肽生物合成，提高胞內(nèi)谷胱甘肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。應(yīng)用球面對稱設(shè)計(jì)優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，使得胞內(nèi)谷胱甘肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)4.47%，產(chǎn)量達(dá)257.3mg/L。

2.2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化:溫度影響代謝過程中各種酶的活性、代謝反應(yīng)速率、菌體生長量。氧氣濃度影響微生物的生長和GSH合成。衛(wèi)功元等[17]研究表明，溶氧對產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)GSH的影響，當(dāng)葡萄糖濃度為30g/L，且通氣量控制在5L/min時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速達(dá)到300r/min可滿足細(xì)胞生長和谷胱甘肽合成對溶解氧的需求。賀小賢等[18]人研究了釀酒酵母突變株YF發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的條件，使用Design Expert軟件的Plackett-Burman設(shè)計(jì)法進(jìn)行分析，利用響應(yīng)面分析法的中心組合原理，對攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量和pH這3個(gè)影響谷胱甘肽生物合成的3個(gè)主要因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果回歸分析。結(jié)果:谷胱甘肽的產(chǎn)量為150.27mg/L。

2.2.3 發(fā)酵過程調(diào)控:目前，發(fā)酵調(diào)控應(yīng)用最多的葡萄糖流加策略有恒速流加、指數(shù)流加、反饋控制流加。針對GSH的發(fā)酵研究還有前體物補(bǔ)加策略，為了提高產(chǎn)量，適應(yīng)于工業(yè)化的要求，近些年來對于發(fā)酵調(diào)控的研究比較多(見表3)。

表3 發(fā)酵調(diào)控研究和結(jié)果

通過對葡萄糖流加研究發(fā)現(xiàn)，采取后期限量流加葡萄糖的方法，可以消除底物抑制，達(dá)到高密度發(fā)酵，延長GSH的合成時(shí)間。但是，通過在線監(jiān)測發(fā)酵液中溶解氧和乙醇的體積分?jǐn)?shù)，運(yùn)用反饋控制系統(tǒng)確定葡萄糖的流加速率，使葡萄糖和乙醇同時(shí)被利用，進(jìn)一步提高了發(fā)酵過程GSH產(chǎn)量[20]。在前體氨基酸中，半胱氨酸為GSH合成的關(guān)鍵氨基酸，它能明顯提高細(xì)胞內(nèi)GSH含量及GSH的比生產(chǎn)速率，但也能阻礙細(xì)胞量的增加。在發(fā)酵中，補(bǔ)加方式應(yīng)采取以盡量減少對細(xì)胞生長的抑制、后期一次性添加的策略[22]。

3 問題與展望

國內(nèi)發(fā)酵法GSH的生產(chǎn)多處于工業(yè)性試驗(yàn)階段，研究主要集中于上游，如高產(chǎn)菌種的選育，發(fā)酵調(diào)控實(shí)現(xiàn)高密度、高產(chǎn)量，也取得了一些成績，但是下游存在提取工藝收率低、產(chǎn)品純度低、成本高、達(dá)不到醫(yī)藥級GSH的質(zhì)量要求的問題。

國內(nèi)的研發(fā)機(jī)構(gòu)也加緊了GSH工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)的開發(fā)，一方面，以高密度發(fā)酵技術(shù)來提高產(chǎn)量，另一方面是分離提取工藝的進(jìn)一步創(chuàng)新，以獲得優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，滿足市場需要。例如上海康鵬化學(xué)有限公司2011年開發(fā)的6噸級固相酶法谷胱甘肽生產(chǎn)線正在進(jìn)行試產(chǎn)，通過努力，爭取研制出年產(chǎn)10噸及以上規(guī)模的生產(chǎn)線，以解決國內(nèi)GSH只能進(jìn)口的局面，并拓展其應(yīng)用領(lǐng)域，加速GSH產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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1004-6879(2013)06-0516-03

2013-09-29)

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