山楂葉總黃酮對大鼠慢性腦缺血時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的影響

封獻(xiàn)敬，曹娜娜，檀榮方，許 麗，武世超，吳曉光

(1.承德醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系2011級，河北承德 067000;2.指導(dǎo)老師)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量最多，約占膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的70%。它不僅對神經(jīng)元起支持、保護(hù)和營養(yǎng)作用，更能促進(jìn)神經(jīng)元的生長，提高神經(jīng)元興奮活性。但當(dāng)慢性腦缺血時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞過度反應(yīng)性增生，可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，并可通過釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)和炎癥介質(zhì)發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，抑制神經(jīng)的再生功能，加重神經(jīng)元的損傷。膠質(zhì)源性纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein，GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞特有的一種細(xì)胞骨架蛋白，GFAP表達(dá)的多少可以反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)。研究表明，山楂葉總黃酮(total flavone of hawthorn leaf，TFHL)對腦缺血神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用[1]。但TFHL對星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響未見報(bào)道。本研究通過觀察TFHL對慢性腦缺血損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生的影響，進(jìn)一步探究TFHL對慢性腦缺血神經(jīng)組織的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 成年雄性清潔級Spague-Dawley大鼠，24只，體質(zhì)量250-280g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào):scxk(京)2006-2009。大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、TFHL組，每組8只。

1.2 藥物與試劑 TFHL，山西振東泰盛制藥有限公司提供，純度98%，用蒸餾水配制，濃度為140mg/ml。GFAP抗體(免抗)、SABC免疫組化試劑盒、DAB試劑盒，均購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物模型制備及給藥 模型組、TFHL組均采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法制備慢性腦缺血模型:2%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉，頸部正中矢狀切口，鈍性分離皮下組織及筋膜，在頸動(dòng)脈三角處游離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎并切斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合切口，術(shù)后24h內(nèi)未蘇醒者剔除，并及時(shí)補(bǔ)遺。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎。術(shù)后第14天開始，TFHL組給予TFHL(140mg/kg/d)灌胃，連續(xù)30d。假手術(shù)組及模型組給予等量生理鹽水灌胃，時(shí)間同TFHL組。

1.4 取材及指標(biāo)檢測 2%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛左心室插管灌注固定，取腦組織，梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)冠狀切片，每隔3片取1張，共選5張。免疫組化法檢測GFAP的表達(dá):石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2孵育，抗原修復(fù);滴加GFAP一抗(1:100稀釋)，4℃孵育過夜;滴加二抗工作液，室溫孵育30min;滴加三抗SABC室溫孵育30min;DAB顯色;蘇木精復(fù)染;梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在400倍顯微鏡下，每只動(dòng)物取3張代表切片，每片隨機(jī)選取5個(gè)視野，顯微攝像后，采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)分析陽性產(chǎn)物面積占視野面積的比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)的形式表示，組間比較采用one-wayANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

GFAP陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，位于星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿及突起內(nèi)。假手術(shù)組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)呈弱陽性，膠質(zhì)細(xì)胞突起較短、較細(xì);與假手術(shù)組比較，模型組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)增多、并呈強(qiáng)陽性表達(dá)，膠質(zhì)細(xì)胞胞體腫脹、突起增粗，出現(xiàn)膠質(zhì)瘢痕;與模型組比較，TFHL組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)明顯減少，胞體腫脹減輕。定量分析結(jié)果:模型組大鼠GFAP的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01);與模型組比較，TFHL組大鼠GFAP的表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見附表。

附表 各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)( ±s)

附表 各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)( ±s)

與假手術(shù)組比較:*P＜0.01，與模型組比較:#P＜0.05

組別 劑量(mg/kg/d) GFAP的表達(dá)假手術(shù)組 - 0.27±0.16模型組 - 1.46±0.67*TFHL組 140 0.97±0.42#

3 討論

慢性腦缺血引起長期腦灌注不足可以導(dǎo)致神經(jīng)組織的嚴(yán)重?fù)p害，其病理過程不僅包括神經(jīng)元的變化，而且存在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的變化。星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)數(shù)量最多、分布最廣的一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，它是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要支持成份，參與多種生理反應(yīng)。在腦損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體變大，數(shù)目增多，出現(xiàn)反應(yīng)性增生。目前對腦缺血的研究主要集中于如何保護(hù)缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞，而對膠質(zhì)細(xì)胞，尤其星形膠質(zhì)細(xì)胞的研究較少。

腦缺血時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)活化并增生，形成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，如損傷嚴(yán)重將形成膠質(zhì)疤[2]。慢性腦缺血可損害海馬突觸可塑性引起學(xué)習(xí)記憶能力降低，腦缺血后海馬出現(xiàn)過度增殖的膠質(zhì)細(xì)胞以及膠質(zhì)疤痕的形成不僅影響正常的局部神經(jīng)回路，而且可能是繼發(fā)癲癇以及認(rèn)知功能損害的重要因素[3]。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性的標(biāo)志蛋白，通過調(diào)節(jié)GFAP表達(dá)，有效抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，防止膠質(zhì)疤痕的形成，將是腦保護(hù)研究的重點(diǎn)。

本研究顯示，模型組大鼠腦組織GFAP的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，提示慢性腦缺血可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化、增生，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[4]。TFHL干預(yù)后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的情況較模型組明顯改善，提示TFHL能抑制腦缺血誘發(fā)的星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，這可能是其腦保護(hù)作用的機(jī)制之一。盡管TFHL確有神經(jīng)保護(hù)作用，值得注意的是反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生是一個(gè)動(dòng)態(tài)的形成過程，因此抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度增生的確切機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

[1]李麗靜,吳曉光，商亞珍.山楂葉總黃酮對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,30(2):148-151.

[2]Rossi D,Brady J,Mohr C.Astrocyte metabolism and signalin during brain ischemia[J].Nat Neurosci, 2007, 10(11): 1377 -1386

[3]Andersson M, Blomstrand F, Hanse E. Astrocytes play a critica role in transient heterosynaptic depression in the rat hippocampa CA1 region[J].J Physiol,2007,585(Pt 3):843 -852.

[4]王搖敏,張秋霞,鄒海艷,等.竹節(jié)參總皂苷對慢性腦缺血大鼠海馬GFAP、GAP-43表達(dá)的影響[J].世界中醫(yī)藥,2013,8(2):183-185.