富氫U W液減輕大鼠腎臟低溫保存期缺血損傷

徐如彬，杜洪印，喻文立，翁亦齊，王永旺，任恒昌

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津市第一中心醫(yī)院麻醉科，天津300192）

腎移植是終末期腎病患者的最佳治療措施。由于需進(jìn)行組織配型及供體轉(zhuǎn)運(yùn)，供腎切取后常需低溫保存于器官保存液中，以減緩器官代謝，保存組織活性。然而，低溫、缺血、缺氧致使保存期移植器官組織缺氧及微循環(huán)障礙，腎小管上皮細(xì)胞損傷甚至死亡[1-2]。長(zhǎng)時(shí)間冷缺血是移植腎功能延遲的主要風(fēng)險(xiǎn)因素之一，嚴(yán)重者導(dǎo)致慢性移植物腎病，移植腎失功能[3-4]。最近研究證實(shí)，即使在移植器官再灌注前，低溫保存所致的器官損傷也有活性氧簇（ROS）的參與[2，5-6]。另有文獻(xiàn)顯示，在低溫所致的細(xì)胞毒性級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，活性氧產(chǎn)生致使下游信號(hào)通路激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[1，7]。因此，在移植器官低溫保存期采取抗氧化措施，可減弱缺血損傷。分子氫（H2）是一種新型有效的抗氧化劑，可選擇性地清除細(xì)胞毒性氧自由基[8]。圍術(shù)期吸入H2或者應(yīng)用含氫液體具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡作用，可顯著減輕移植所致的移植器官損傷[9-13]。最近一些研究將H2加入器官保存液中，發(fā)現(xiàn)在低溫保存期應(yīng)用H2，可減輕移植所致缺血再灌注損傷，改善移植器官預(yù)后[11-13]。然而，應(yīng)用含氫器官保存液能否減輕低溫保存期相關(guān)損傷尚未明確。本研究將 H2加入 University of Wisconsin器官保存液（UW液），制成富氫UW（HRUW）液，驗(yàn)證其是否對(duì)低溫保存大鼠腎臟具有保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康成年雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200～250g，購(gòu)于中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，無(wú)特殊病原體（SPF）環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

1.1.2 主要儀器 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司，BX51TF）；分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Electron公司，UNICAM UV300）；氫氣發(fā)生器（北京中科匯恒技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，ZK-300）；氣相色譜分析儀（美國(guó)Agilent公司，6890N GC）。

1.1.3 主要試劑 UW 液（美國(guó) Bristol-Myers Squibb公司）；脂質(zhì)氧化（MDA）檢測(cè)試劑盒、錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）活性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BioVision公司，K106）。

1.1.4 HRUW液制備 按Buchholz等[11]的方法，將氫氣沖入200mL UW液中，持續(xù)30min，制備HRUW液，γ射線殺菌，實(shí)驗(yàn)時(shí)使用新鮮制備的HRUW液且每6h更換一次以保證穩(wěn)定的氫濃度。1.2研究方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 參照Mitchell等[14]的方法進(jìn)行，腹腔注射10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉大鼠，腹正中切口暴露左側(cè)腎臟，顯微血管鉗阻斷下腔靜脈及腹主動(dòng)脈上、下端，由腹主動(dòng)脈下端插入灌注管。在下腔靜脈下端剪一開(kāi)口，灌注UW液，速度1.5～2.0mL/min，左腎和所屬血管完全蒼白，且自下腔靜脈流出液變清澈時(shí)停止灌注，摘取左腎。腎臟低溫保存后，經(jīng)中部橫切分為上下兩部分，上半部浸于4%中性甲醛溶液中過(guò)夜，石蠟包埋，用于組織形態(tài)學(xué)觀察。下半部迅速置于液氮中保存，用于提取蛋白檢測(cè)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只。正常對(duì)照組（C組）：腎臟不進(jìn)行保存；UW液保存組（UW組）：將腎臟于4℃UW液中保存48h；HRUW液保存組（HRUW組）：將腎臟于4℃HRUW液中保存48h。

1.2.3 腎臟組織的形態(tài)學(xué)觀察 腎組織樣本保存于4%中性甲醛溶液內(nèi)，石蠟包埋，制成5μm薄片，行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察，依照Gobe的評(píng)分方法[15]分析腎小管上皮細(xì)胞的損傷程度。

1.2.4 腎臟組織內(nèi)丙二醛含量、Mn-SOD活性、Caspase-3活性的檢測(cè) 分別采用MDA檢測(cè)試劑盒、Mn-SOD活性檢測(cè)試劑盒、Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒，按說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

圖1 低溫保存后大鼠腎臟標(biāo)本的組織形態(tài)學(xué)改變（HE×400） Fig 1 Hypothermic storage-induced morphological renal changes（HE×400）

2.1 腎臟組織形態(tài)學(xué)變化 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化見(jiàn)圖1。C組腎臟腎小管結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)明顯病變；UW組可見(jiàn)腎小管損傷嚴(yán)重，小管明顯擴(kuò)張，刷狀緣損傷嚴(yán)重甚至缺失，小管細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯空泡，細(xì)胞核深染，出現(xiàn)較多凋亡細(xì)胞；HRUW組病理改變較UW組明顯減輕，部分腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落，凋亡細(xì)胞較UW組明顯減少。各組腎小管損傷的半定量評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖2。UW組腎小管損傷評(píng)分明顯高于C組（P<0.01），HRUW組腎小管損傷評(píng)分明顯低于UW組（P<0.05）。

圖2 HRUW液對(duì)腎小管損傷評(píng)分的影響Fig 2 The effects of HRUW solution on tubular injury scores

2.2 腎臟組織內(nèi)MDA含量 UW組及HRUW組腎臟組織內(nèi)MDA含量均高于C組（P<0.01）；HRUW組腎臟組織內(nèi)MDA含量低于UW組（P< 0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 HRUW液對(duì)腎組織內(nèi)MDA含量的影響Fig 3 The effects of HRUW solution on MDA levels in renal tissue

2.3 各組腎臟組織內(nèi)Mn-SOD活性變化 與C組相比，UW組和HRUW組腎臟組織內(nèi)Mn-SOD活性均顯著降低（P<0.01）；HRUW組腎臟組織內(nèi)Mn-SOD活性明顯高于UW組（P<0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4 HRUW液對(duì)腎組織內(nèi)Mn-SOD活性的影響Fig 4 The effects of HRUW solution on renal Mn-SOD activity

2.4 各組腎臟組織內(nèi)Caspase-3活性變化 與C組相比，UW組和HRUW組腎臟組織內(nèi)Caspase-3活性均顯著增高（P<0.01）；HRUW組腎臟組織內(nèi)Caspase-3活性明顯低于UW組（P<0.01）。見(jiàn)圖5。

圖5 HRUW液對(duì)腎組織內(nèi)Caspase-3活性的影響Fig 5 The effects of HRUW solution on renal Caspase-3activity

3 討論

本研究將H2充入U(xiǎn)W液中用于大鼠腎臟低溫保存階段，首次證明富氫UW液減輕低溫保存期離體大鼠腎臟冷缺血損傷。

尸體供體器官常需經(jīng)歷一段低溫保存時(shí)期。然而，低溫、缺血、缺氧常導(dǎo)致低溫保存器官產(chǎn)生嚴(yán)重的冷缺血損傷。嚴(yán)重的冷缺血損傷增加移植后器官功能恢復(fù)延遲的發(fā)生率，影響移植器官的長(zhǎng)期預(yù)后。最近的文獻(xiàn)顯示，低溫保存器官產(chǎn)生ROS，激活下游信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，低溫保存器官產(chǎn)生冷缺血損傷[1，7]。H2是一種新型有效的抗氧化劑，可選擇性地清除細(xì)胞毒性氧自由基，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎癥、抗凋亡作用[8]。

移植器官在低溫保存階段產(chǎn)生ROS，與膜多不飽和脂肪酸穩(wěn)定結(jié)合，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，擾亂膜流動(dòng)性，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，致使組織損傷。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其含量反映脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度及水平[16]。Mn-SOD是一種存在于線粒體內(nèi)的核編碼蛋白酶，可將超氧化物歧化為過(guò)氧化氫，后者通過(guò)過(guò)氧化物酶或谷胱甘肽過(guò)氧化物酶分解為水。Mn-SOD是線粒體內(nèi)的主要抗氧化劑，代表組織清除ROS的能力[17]。本研究結(jié)果顯示，離體腎臟在UW液中長(zhǎng)時(shí)間低溫保存后，組織內(nèi)MDA含量顯著升高，而HRUW液組腎臟組織MDA含量較UW液組明顯降低，同時(shí)Mn-SOD活性增強(qiáng)，也即消耗減少，表明將H2加入器官保存液中可清除低溫保存器官產(chǎn)生的ROS，產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激作用，從而減輕移植器官低溫保存損傷。

凋亡是低溫保存器官細(xì)胞死亡的一種重要形式，Caspase-3的激活被認(rèn)為是凋亡過(guò)程的關(guān)鍵步驟，它的抑制可以阻止細(xì)胞凋亡[18]。既往研究顯示，在器官保存液中加入抗氧化劑或Caspase抑制劑可以抑制保存器官的細(xì)胞凋亡，減輕組織損傷[15，19]。本研究中，UW組腎組織形態(tài)學(xué)損傷嚴(yán)重，腎小管損傷評(píng)分顯著升高，凋亡細(xì)胞增加，同時(shí)腎組織Caspase-3活性明顯升高，表明移植器官長(zhǎng)時(shí)間低溫保存致使腎組織細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生低溫保存缺血損傷，這與此前的一些研究結(jié)果一致[1-2，8，19]。HRUW組腎組織形態(tài)學(xué)改變較UW組明顯改善，同時(shí)腎組織Caspase-3活性降低，表明往器官保存液中充入H2可以抑制低溫保存器官細(xì)胞凋亡。低溫保存期和再灌注期是移植器官遭受損傷的兩個(gè)重要階段。既往有研究顯示富氫器官保存液可減輕器官移植所致的缺血再灌注損傷，抑制移植后細(xì)胞凋亡，改善移植器官長(zhǎng)期預(yù)后[11-13]。本研究結(jié)果表明，即使僅在再灌注期前的器官低溫保存階段，使用抗氧化劑H2也可抑制保存器官的細(xì)胞凋亡，減輕移植器官的低溫保存損傷。

H2作為抗氧化劑已經(jīng)用于大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，它可以迅速透過(guò)生物膜性結(jié)構(gòu)，彌散到胞質(zhì)、線粒體、細(xì)胞核產(chǎn)生作用[20]。富氫UW液制備方便，使用安全。最近已有用于制備臨床用富氫液體的設(shè)備上市[13]，富氫UW液將為臨床上改善移植器官低溫保存條件提供一種選擇。

綜上所述，將H2加入U(xiǎn)W液用于大鼠離體腎臟低溫保存階段，可降低低溫缺血所致的氧化應(yīng)激作用，抑制細(xì)胞凋亡，減輕大鼠腎臟低溫保存期損傷。

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