依達(dá)拉奉對(duì)吸入性肺損傷大鼠肺保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

肖長(zhǎng)栓，劉 群，張建明，馮世海，趙永健，施 耘，劉婭平

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津市第四醫(yī)院燒傷科，天津300222）

吸入性損傷是呼吸道和肺組織的共同損傷。由于其發(fā)病隱匿，病情危重，同時(shí)具有熱力和化學(xué)物質(zhì)損害的特點(diǎn)，所以其治療仍然是一個(gè)難點(diǎn)。吸入性損傷后，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）及缺氧中毒等因素可導(dǎo)致其他臟器繼發(fā)性損傷，最終導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（MODF）發(fā)生。依達(dá)拉奉是一種強(qiáng)效的新型氧自由基清除劑，化學(xué)名為3-甲基-l-苯基-2-吡唑啉-5酮，研究表明，其可以清除氧自由基，在高氧肺損傷和順鉑所致的腎臟損傷中有一定效果[1-2]。但對(duì)吸入性損傷的具體治療效果尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)依達(dá)拉奉對(duì)煙霧吸入性損傷大鼠模型不同作用時(shí)間來(lái)研究其對(duì)自由基及炎癥介質(zhì)的影響，探索其對(duì)煙霧吸入性肺損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 依達(dá)拉奉（中國(guó)藥品生物制品研究所），大鼠IL-6ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司)，大鼠SOD試劑盒、MDA試劑盒、NO試劑盒、iNOS試劑盒 (南京建成公司)，微量加樣器（eooendorf），ELX800UV酶標(biāo)檢測(cè)儀（BIOTEK），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS），Centrifuge5702離心機(jī)（EPPENDORF公司），LEICA石蠟切片機(jī)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 雄性SD大鼠40只，質(zhì)量（200±20）g（天津春樂(lè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供）。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組10只，正常對(duì)照組（A組），致傷空白組（B組），致傷依達(dá)拉奉8h治療組(C組)，致傷依達(dá)拉奉24h治療組（D組）。除A組外，其余各組大鼠制作煙霧吸入性損傷模型（根據(jù)謝爾凡等的方法[3]）。模型制作成功后，C組及D組腹腔注射依達(dá)拉奉（9mg/kg），B組同時(shí)腹腔注射等量生理鹽水。模型制作及給藥過(guò)程中無(wú)大鼠死亡等意外情況發(fā)生。

1.3 標(biāo)本采集 分別于致傷8h及24h后，C組及D組取大鼠腹主動(dòng)脈血5mL，3000r/min離心15min后取上清液，-20℃冷凍保存待測(cè)IL-6、TNF-α。取左肺組織及時(shí)保存于-70℃冰箱中待測(cè)NO、MOD、SOD、iNOS。以4%的甲醛灌洗肺動(dòng)脈以固定肺組織，取出右肺，以絲線結(jié)扎肺門后置于4%甲醛中固定，留待病理檢查。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)及方法 （1）血清IL-6、TNF-α的檢測(cè):參照試劑盒說(shuō)明書以雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，依次用pg/mL、ng/L作為單位。（2）肺組織SOD、NO、MDA、iNOS的檢測(cè)：濾紙吸干肺組織表面污物，制備肺組織勻漿，考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定法測(cè)勻漿液中蛋白濃度。然后參照試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定SOD、NO、MDA及iNOS含量，分別以U/mg、μmol/mg、nmol/mg、U/mg為單位表示。（3）制作蘇木精-伊紅（HE）染色切片：將以4%甲醛固定好的右肺組織依次進(jìn)行脫水、石蠟包埋、制作切片，待HE染色后以光鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)及正態(tài)檢驗(yàn)，±s為表現(xiàn)形式，用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 肺病理切片檢查 光鏡下，A組組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，肺泡腔中未見(jiàn)滲出的白細(xì)胞，肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔光滑均勻（圖1）。B組組織可見(jiàn)肺泡間隔明顯不均，不同程度的肺泡萎陷和擴(kuò)張，大量炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤(rùn)肺泡和小氣道，肺泡組織結(jié)構(gòu)不清晰（圖2）。C組（圖3）和D組（圖4）肺組織可見(jiàn)肺泡仍有一定程度的萎陷和擴(kuò)張，大小形態(tài)尚不規(guī)則，毛細(xì)血管仍充血擴(kuò)張，管周尚有一定數(shù)量的紅、白細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔炎性細(xì)胞浸潤(rùn)輕于B組。D組損傷程度又小于C組。

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平的比較 見(jiàn)表1。與A組相比較，B、C、D組IL-6及TNF-α水平明顯升高（P<0.01）。與B組相比較，C、D組TNF-α, IL-6水平明顯降低（P<0.01）。與C組比較，D組TNF-α，IL-6水平明顯降低（P<0.01）。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（±s）Tab 1 Comparison of TNF-α,IL-6in the serum of the rats in each group（±s）

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（±s）Tab 1 Comparison of TNF-α,IL-6in the serum of the rats in each group（±s）

與A組相比，△P<0.01，#P<0.01，*P<0.01；與B組相比，▲P<0.01☆P<0.01；與C組相比，□P<0.01

組別A組B組C組D組n 10101010TNF-α/(pg/mL) 112.2±3.01379.5±8.03△297.8±5.94#▲199.5±6.59*☆□IL-6/（pg/mL）124.5±2.37356.2±2.34△235.3±6.31#▲145.4±8.77*☆□

2.3 各組大鼠肺組織MDA、NO、iNOS及SOD水平的比較 見(jiàn)表2。與A組比較，B、C、D組MDA、i－NOS及NO水平均升高（P<0.01），SOD水平均降低（P<0.01）。與B組比較，C、D組NO、MDA、iNOS水平均降低（P<0.01），C組SOD水平升高（P<0.05），D組SOD水平明顯升高（P<0.01）。與C組相比，D組NO、MDA、iNOS水平降低（P<0.01），SOD水平升高（P<0.01）。

表2 各組大鼠肺組織MDA、NO、iNOS、SOD水平比較（±s）Tab 2 Comparison of MDA,NO,iNOS,SOD in the lung tissue of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠肺組織MDA、NO、iNOS、SOD水平比較（±s）Tab 2 Comparison of MDA,NO,iNOS,SOD in the lung tissue of rats in each group（±s）

與A組比較，△P<0.01，#P<0.01，*P<0.01，◇P<0.05；與B組比較，▲P<0.01，☆P<0.01，◆P<0.05；與C組相比，○P<0.01，●P<0.05

組別A組B組C組D組n 10101010MDA/(nmol/mg）2.59±0.097.05±0.19△5.05±0.16#▲3.98±0.15*☆○NO/（μmol/mg）0.91±0.192.68±1.06△1.91±0.55#▲1.22±0.64*☆○iNOS/（U/mg）0.82±0.331.92±0.26△1.57±0.34#▲1.37±0.20*☆○SOD/（U/mg）336.64±2.84112.10±1.03◇134.39±2.03◆200.79±2.95●

3 討論

吸入性損傷病情發(fā)展迅速，機(jī)制復(fù)雜，是嚴(yán)重威脅燒傷患者生命的臨床常見(jiàn)疑難癥之一。盡管一些細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)被證實(shí)在肺損傷和全身繼發(fā)性損害中有一定作用，但在抑制過(guò)量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子方面的問(wèn)題一直未能得到有效解決，因此，尋找可行有效的抗炎藥物及其探索具體使用方法就成為我們當(dāng)前共同面臨的難題。

依達(dá)拉奉是一種新型的自由基清除劑，可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。因其對(duì)腦細(xì)胞有保護(hù)作用，臨床上廣泛應(yīng)用于急性腦梗死患者[4]。研究發(fā)現(xiàn)其還可對(duì)腸缺血再灌注等有氧自由基參與的疾病有保護(hù)作用[5]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，依達(dá)拉奉可使大鼠組織中MDA、 TNF-α水平降低，肝內(nèi)iNOS含量降低，起到保護(hù)肝臟的目的[6]。依達(dá)拉奉可能通過(guò)減輕自由基對(duì)細(xì)胞膜糖類及脂質(zhì)的直接破壞作用，對(duì)細(xì)胞膜內(nèi)外蛋白質(zhì)損傷程度及對(duì)細(xì)胞核酸的破壞作用，來(lái)維持細(xì)胞生命周期的穩(wěn)定，提高抗氧化酶活性。在吸入性損傷的發(fā)病過(guò)程中，上述破壞作用很重要，所以筆者認(rèn)為依達(dá)拉奉可能對(duì)吸入性損傷具有肺保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)HE病理切片顯示致傷各組大鼠肺泡間隔不均，肺泡形態(tài)極不規(guī)則，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，表明煙霧致傷模型制作成功。吸入性損傷可延長(zhǎng)通氣時(shí)間，容易繼發(fā)感染，使死亡率增加[7]。吸入性損傷使巨噬細(xì)胞過(guò)度刺激產(chǎn)生大量氧自由基、IL-6、TNF-α等，致肺毛細(xì)血管通透性增加，肺水腫程度加重[8]。另外，吸入性損傷使中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞產(chǎn)生釋放IL-6、TNF-α等多種炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子，使血管通透性增高，滲出增多，小氣道阻塞，使肺水腫程度進(jìn)一步加重[9]。血漿中IL-6在炎癥性疾病中被視為預(yù)示多臟器功能衰竭及死亡的重要標(biāo)志[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)血清TNF-α和IL-6水平，來(lái)間接反映肺組織炎性損傷的程度。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，采用腹腔注射依達(dá)拉奉9mg/kg作為實(shí)驗(yàn)劑量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B、C、D組血清IL-6、TNF-α水平較A組升高，其中C組較B組水平有所降低，D組又較C組低。提示依達(dá)拉奉對(duì)吸入性肺損傷有保護(hù)作用。

吸入性損傷刺激自身抗氧化機(jī)制啟動(dòng)，使生理狀態(tài)下就存在于體內(nèi)的超氧化物歧化酶SOD活性增加，其活性的高低表示機(jī)體抑制氧自由基能力的強(qiáng)弱。通過(guò)檢測(cè)MDA（又稱脂質(zhì)過(guò)氧化物酶）的活性高低可間接反映組織受自由基攻擊導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[12]。NO是一種致炎因子，少量的內(nèi)源性的NO能使血管擴(kuò)張，改善微循環(huán)，能對(duì)肺組織起保護(hù)作用；但過(guò)量的NO會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，進(jìn)一步導(dǎo)致呼吸爆發(fā)，損傷肺組織[13]。肺組織中的iNOS的表達(dá)能影響NO的生成，并且提高SOD的活性及減少其消耗，能有效地發(fā)揮肺保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)NO及iNOS的活性高低反映組織受損傷的程度[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B、C、D組肺組織MDA、NO、iNOS水平較A組明顯升高，SOD水平平均降低。肺組織MDA、NO、iNOS水平C組和D組較B組低，D組又較C組低，SOD水平C組和D組較B組高，D組又較C組高。病理顯示B、C、D組肺泡結(jié)構(gòu)不清晰，大量紅白細(xì)胞浸潤(rùn)，其中B組損傷最嚴(yán)重，C組與D組損傷較B組輕，D組損傷程度又小于C組。所有結(jié)果顯示依達(dá)拉奉不僅減低了由煙霧吸入性損傷引起的促炎因子IL-6、TNF-α水平，還能降低MDA、iNOS、NO的水平，更能提高具有抗氧化功能的SOD的水平，肺泡結(jié)構(gòu)及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度也明顯減輕，說(shuō)明依達(dá)拉奉在抑制炎癥因子的過(guò)程中及抗氧化作用中起了重要作用。

本實(shí)驗(yàn)研究證明，依達(dá)拉奉可能通過(guò)抑制自由基和部分炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放減輕煙霧吸入性肺損傷大鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)，對(duì)肺組織起到一定的保護(hù)作用。但在給藥方式、用藥濃度和用藥時(shí)機(jī)的選擇上還需深入研究。

（本文圖1～4見(jiàn)封三）

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