結直腸癌線粒體DNA拷貝數改變及4 977片段缺失

王志津，郭曉明，張鋆歆，張振華，徐 偉，王小鵬

（1.中國人民解放軍第三○五醫(yī)院消化科，北京 100017；2.中國人民解放軍第三○九醫(yī)院老年病科，北京 100091；3.中國人民解放軍第三○五醫(yī)院病理科，北京100017）

結直腸癌線粒體DNA拷貝數改變及4 977片段缺失

王志津1，郭曉明2*，張鋆歆3，張振華1，徐 偉1，王小鵬1

（1.中國人民解放軍第三○五醫(yī)院消化科，北京 100017；2.中國人民解放軍第三○九醫(yī)院老年病科，北京 100091；3.中國人民解放軍第三○五醫(yī)院病理科，北京100017）

目的 探討結直腸癌（colorectal cancer，CRC）線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷貝數異常、線粒體DNA 4 977 bp大片段缺失與TNM分期和分化程度的關系。方法選取118例石蠟標本大腸癌組織，分別提取總DNA。以ND1和β-actin為目的基因，進行SYBR Green熒光定量PCR擴增，并用PCR擴增方法檢測4 977片段缺失情況，探討它們與不同TNM分期和分化程度之間的關系。結果CRCⅠ和Ⅱ期癌組織平均拷貝數（2ND1/βactin）分別為128.42±31.25和115.12±47.15，Ⅲ和Ⅳ期癌組織平均拷貝數為105.22±16.35和99.45±28.46。Ⅰ和Ⅱ期的拷貝數明顯高于Ⅲ和Ⅳ期的拷貝數（P＜0.01），癌組織低、中、高分化的平均拷貝數分別為101.34± 41.35、112.33±42.32和127.22±31.23（P＜0.01），4 977片段缺失率為15.25％（18/118），線粒體DNA4977bp缺失與患者的分期呈負相關，與分化程度無明顯關系。結論線粒體DNA 4 977 bp缺失在大腸癌的早期階段起到了重要作用，隨著腫瘤的進展，拷貝數逐漸減少，線粒體DNA拷貝數的變化及大片段缺失在腫瘤的發(fā)病機制中可能起一定作用。

結直腸腫瘤；DNA，線粒體；聚合酶鏈反應

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）在全世界癌癥的發(fā)生率和病死率中占第3位，嚴重威脅人們的健康。最近人們對氧化損傷可能導致腫瘤的推理產生了濃厚的興趣，氧化損傷的靶器官作用于細胞的線粒體。與核DNA不同，線粒體DNA高水平存在于每個細胞中，通常有103～104拷貝［1］。隨著人們對線粒體研究的深入，線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變在很多部位的腫瘤中均有報道，如肺癌、食管癌、乳腺癌等［2-4］。mtDNA拷貝數及4 977片段的缺失是否隨著大腸癌惡性程度而有所變化，目前尚不清楚。因此，本研究采用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR對118例結直腸癌線粒體DNA拷貝數進行檢測，并用PCR法檢測4 977片段的缺失，以探討CRC mtDNA拷貝數的差異及4 977片段缺失在不同TNM分期和分化程度中的變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2005年1月—2006年10月于我院手術切除的CRC患者118例，所有患者術前均未接受過放療和化療。男性61例，女性57例，年齡27～85歲，平均59.78歲。其中Ⅰ期8例，Ⅱ期55例，Ⅲ期40例，Ⅳ期15例；高分化33例，中分化64例，低分化21例，所有病理標本均經病理科2位專家重新診斷篩選。

1.2 試劑與儀器。

1.2.1 試劑：蛋白酶K（北京欣經科生物技術有限公司）；無水乙醇、二甲苯、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇（北京益利精細化工）；瓊脂糖（Spain）；50×TAE（北京鼎國生物技術有限公司）；DL2000 Ladder（北京天根公司）；Escherichia coli DH10B感受態(tài)細胞（北京基因組研究所），質粒pGEM?-T Vector試劑盒（Promega美國），QIA快速PCR純化試劑盒（QIAGEN公司，美國）。

1.2.2 儀器：GeneAmp PCR System 2700型PCR擴增儀（ABI公司，美國），熒光定量PCR儀（MJ Research公司，美國），低溫高速離心機（SORVALL公司，德國），凝膠圖像分析系統（Viber Lourmat，美國），-80℃低溫冰箱（Sanyo，日本）。

1.3 方法

1.3.1 標本DNA提?。喝⌒g中切除的結腸癌標本，切取癌灶中心部分組織蠟塊作為癌組織，取手術切緣的蠟塊作為癌周組織，共118個病理標本蠟塊，切5張10μm和1張4μm厚的切片。用經典飽和酚-氯仿-異戊醇法提取總DNA（包括核DNA和mtDNA）。將所得的DNA溶于雙蒸水，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。紫外分光密度儀檢測所提取DNA濃度為（100.23±40.12）mg/L。

1.3.2 質粒的克隆及鑒定：選取mtDNA的ND1和核DNA的β-actin為目的片段，引物均為上海英駿生物工程技術服務有限公司合成，ND1引物序列，F 5'-TAATGCTTACCGAACGAA-3'，R 5'-TTATGGCGTCAGCGAAGG-3'，目的片段104 bp，β-actin引物序列，F5'-GCAAAGTTCCCAAGCACA-3'，R5'-AAGCA AGCAGCGGAGCAG-3'，目的片段105 bp，PCR反應體系（10μL）組成如下，rTaq酶0.08μL，10×buffer（Mg2+free）1μL，MgCl20.7μL，dNTPMixture 0.7μL，上下游引物1μL，模板DNA1μL，ddH2O 5.52μL。反應條件，94℃預變性5min，40個循環(huán)94℃變性30s、57℃退火45s、72℃延伸45s，最后72℃延伸10min。將PCR產物純化回收，連接到pGEM-T載體上，并測序以驗證。

1.3.3 標準曲線：ND1及β-actin基因標準曲線的制作是將帶有目的基因的質粒DNA做108、107、106、105、104倍梯度稀釋，并以這些稀釋的DNA為模板進行熒光定量PCR擴增，根據不同濃度的標準品測得的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數（threshold cycle，Ct）值繪制標準曲線。

1.3.4 熒光定量PCR：Sybergreen-I 0.5μL，10× buffer 1μL，dNTPMixture 0.25μL，上下游引物2μL，標準品或樣品1μL，ddH2O 5.25μL，反應體系體積10μL。95℃預變性5min，40個循環(huán)95℃變性10s，60℃退火10s，68℃延伸20s。

1.3.5 線粒體DNA拷貝數的計算：核DNA被選擇作為定量mtDNA拷貝數的內對照。由于β-actin基因是一個已知序列的核單拷貝基因，因此本實驗選擇其作為二倍體核基因組含量的標記。以mtDNA ND1和核單拷貝基因β-actin分別作為線粒體和核DNA拷貝數的標記，線粒體DNA的拷貝數/細胞= 2×ND1/β-actin。

1.3.6 線粒體DNA 4 977片段的缺失檢測：檢測線粒體DNA 4 977bp缺失突變的存在情況所用引物Fnt8 412～nt8 436，5'-TACTCCTTACACTATTCCTC-ATCAC-3'，261bp；Rntl 3 650～ntl 3 626，5'-GGGGAAGCGAGGTTGACCTGTTAGG-3'。

PCR反應體系（10μL）組成如下。DNA（100mg/L）2μL；10×buffer（Mg2+free）1μL；Mg2+（25mmol/L）0.5μL；dNTP（2.5mmol/L）0.5μL；primer（1pmol/L）1μL；LA-Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.1μL；ddH2O 4.9μL；總體積10μL。反應條件，94℃預變性3min→94℃變性30s、62℃退火30s、68℃延伸45s，共30個循環(huán)→72℃繼續(xù)延伸10min。

如果樣本能擴增出261bp片段，說明樣本中有4 977bp片段的缺失。如果樣本擴增不出片段，說明無缺失。

2 結果

2.1 結直腸癌組織線粒體DNA拷貝數：CRCⅠ和Ⅱ期癌組織平均拷貝數（2ND1/β-actin）分別為128.42±31.25和115.12±47.15，Ⅲ和Ⅳ期癌組織平均拷貝數為105.22±16.35和99.45±28.46。癌組織低、中、高分化的平均拷貝數分別為101.34± 41.35、112.33±42.32和127.22±31.23。Ⅰ、Ⅱ期平均數為117.24±40.21，高于Ⅲ、Ⅳ期的平均數102.23±30.56（t=2.26，P＜0.05），低分化組拷貝數明顯低于高分化組（t=2.61，P＜0.01）。

2.2 結腸癌線粒體DNA 4 977bp片段缺失情況：Ⅰ期CRC中缺失6例，Ⅱ期CRC中缺失6例，Ⅲ期CRC中缺失5例，Ⅳ期CRC中缺失1例，總缺失率為15.25％（18/118）。癌組織低、中、高分化中4 977bp片段缺失分別是4、6、8例，CRC患者的癌組織中，線粒體DNA 4 977bp片段缺失與患者的分期呈負相關（χ2=23.98，P＜0.01），與分化程度無明顯關系。

3 討論

人體細胞，除了紅細胞，都包含線粒體，細胞通過氧化磷酸化產生近95％的能源。mtDNA呈閉環(huán)雙鏈，全長16 569個堿基，線粒體呼吸鏈氧化磷酸化不但與mtDNA結構的完整性相關，而且與其拷貝數相關，mtDNA拷貝數增加被認為總線粒體呼吸功能的代償。線粒體DNA突變率是核DNA的10～100倍，這與mtDNA易受活性氧的攻擊、缺乏組蛋白保護和基因修復能力有限等特性相關。在各種細胞、組織和器官的線粒體DNA的拷貝數是不同的，這種差異，也可能由于內部或外部微環(huán)境的改變而引起，包括缺氧和類固醇激素的刺激［5-6］。最近，因為這種細胞器扮演著各種角色而引起科學家們的興趣，它包括能源生產、電子傳輸、細胞運動、細胞增殖和細胞凋亡等。已發(fā)現在許多腫瘤中，線粒體DNA出現點突變、編碼區(qū)的突變和缺失。在mtDNA突變中，4 977bp片段缺失最常見［7］。本研究結果顯示，結腸癌細胞中，mtDNA 4 977bp片段缺失與患者的分期呈負相關，這可能表明4 977bp片段缺失是腫瘤早期的一種表現。腫瘤在生長初期，在外界氧化應激損傷刺激下，細胞產生一些較小的線粒體，它可能成為維持細胞快速增殖，抑制細胞有氧呼吸，增加糖酵解的重要途徑。

mtDNA的功能實現不但與其結構完整性有關，而且與其拷貝數有關。Thyagarajan等［8］發(fā)現mtDNA拷貝數的增加與乳腺癌的發(fā)生率呈正相關。但Dai等［9］發(fā)現在肺癌組織中mtDNA的平均拷貝數顯著低于相鄰正常的肺組織的拷貝數，并且發(fā)現微衛(wèi)星不穩(wěn)定組中mtDNA的拷貝數明顯低于穩(wěn)定組。線粒體對許多致癌因素敏感，它是產生活性氧的主要場所，也成為其主要的攻擊目標。線粒體對活性氧高度敏感，當細胞受到外源性氧化劑攻擊時mtDNA拷貝數增加。mtDNA拷貝數增加是總線粒體呼吸功能的代償。但腫瘤生長時間長后，糖酵解占供能的比例逐漸增加，線粒體拷貝數增加逐漸下降，甚至可能低于正常。本研究發(fā)現CRC癌組織（Ⅲ和Ⅳ期）的mtDNA拷貝數顯著低于Ⅰ和Ⅱ期，mtDNA拷貝數與腫瘤分化程度成負相關，中、低分化比高分化組的拷貝數低，惡性程度相對較高。低分化組的CRC癌組織mtDNA拷貝數與高分化組相比差異有統計學意義。早期CRC mtDNA拷貝數尚無明顯變化，而到中晚期時癌組織mtDNA拷貝數已明顯降低，預后較差。對于CRC mtDNA拷貝數的檢測及大片段缺失可能為臨床診斷、判斷預后及復發(fā)提供一些參考。

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［5］POTENZA L，CALCABRINI C，DE BELLIS R，et al.Effects of reactive oxygen species on mitochondrial content and integrity of human anastomotic colorectal dehiscence：a preliminary DNA study［J］.Can JGastroenterol，2011，25（8）：433-439.

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［8］THYAGARAJAN B，WANG R，NELSON H，et al.Mitochondrial DNA copy number is associated with breast cancer risk［J］.PloS One，2013，8（6）：e65968.

［9］DAI JG，ZHANG ZY，LIU QX，et al.Mitochondrial genome microsatellite instability and copy number alteration in lung carcinomas［J］.Asian Pac JCancer Prev，2013，14（4）：2393-2399.

（本文編輯：趙麗潔）

COPY NUMBER CHANGE AND 4 977bp DELETION OFm tDNA IN COLORECTAL CANCER

WANG Zhijin1，GUO Xiaoming2*，ZHANG Yunxin3，ZHANG Zhenhua1，XUWei1，WANG Xiaopeng1（1.Department of Gastroenterology，305 Hospital of PLA，Beijing 100017，China；2.Department of Geriatrics，309 Hospital of PLA，Beijing 100017，China；3.Department of Pathology，305 Hospital of PLA，Beijing 100017，China）

Objective To study the relationship between mitochondrial DNA copy number abnormalities，4 977bp deletion with TNM and differentiation of colorectal cancer.M ethods Total DNA was extracted from cancerous tissues in 118 colorectal carcinoma samples.Using the SYBR GreenⅠquantitative polymerase chain reaction，the mitochondrial to nuclear DNA ratio was determined by quantification of ND1 andβ-actin.The detection of 4 977bp deletion was tested by PCR amplification. Results Mean 2ND1/β-actin DNA ratios for cancerous tissues of CRC in early stage（ⅠandⅡ）were 128.42±31.25 and 115.12±47.15，respectively，and were 105.22±16.35 and 99.45±28.46 respectively in advanced staged（ⅢandⅣ）CRC tissues.The copy number in early stagewas higher than that in advomced stage.The mean mtDNA copy number from poorly，moderately and well differentiated sampleswere respectively 101.34±41.35，112.33±42.32，127.22±31.23（P＜0.01）.The ratio of 4 977bp deletion was15.25％（18/118），and the deletion ofmitochondrial DNA 4 977bp was negatively correlated with the stage，and was no significant relationship with the differentiation degree.ConclusionThe mitochondrial DNA 4 977 bp deletion plays an important role in the early stages of colorectalcancer，and mtDNA copy numberswere negatively correlated with the differentiation degree，the variation of copy number and large deletions in mtDNA may play a role in the pathogenesis of tumors.

colorectal neoplasmsr；DNA，mitochondrial；polymerase chain reaction

R735.3

A

1007-3205（2013）11-1372-04

2013-07-02；

2013-09-24

王志津（1951-），男，天津人，中國人民解放軍第三○五醫(yī)院主任醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事胃腸道疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：gxm19775555@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.11.004