阿爾茨海默病相關(guān)生物標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展

李錫海，于明，吳金美*

(1.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212003;2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江212001)

阿爾茨海默病(Alzheimer＇sdisease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的、進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，主要病理特征為腦神經(jīng)細(xì)胞外老年斑(senile plaques，SP)和腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)。AD 的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，迄今尚未完全明確。普遍認(rèn)為AD 為多因素影響的綜合征，患者的年齡和家族史為最大致病危險(xiǎn)因素。

AD 經(jīng)由癥狀前AD、輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment，MCI)逐步發(fā)展成。AD 患者的分子病理學(xué)改變先于認(rèn)知功能損害數(shù)年甚至數(shù)十年，因此，在人體中及早發(fā)現(xiàn)典型的AD 樣病理物質(zhì)是早期診斷AD 的關(guān)鍵。臨床上診斷AD 主要借助病史、神經(jīng)心理鑒定以及排除其他癡呆類型等，但上述方法的特異性和靈敏度都不高。所以，尋找靈敏度高和特異性強(qiáng)的AD 生物學(xué)標(biāo)志物并應(yīng)用于臨床診斷就顯得尤為重要。

1 與AD 相關(guān)的主要生物標(biāo)志物

1.1 淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)與β-淀粉樣蛋白(amyloid beta，Aβ)

APP基因位于21q21.1 ～21.3，約為300 kb，含有19 個(gè)外顯子。由該基因編碼的蛋白——APP，經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶水解生成Aβ 片段，后者是AD患者腦中SP 的主要成分。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Aβ 具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。AD 的發(fā)生與Aβ 的過(guò)度生成及在腦內(nèi)大量沉淀、堆積有關(guān)。Aβ 是各種因素誘發(fā)AD 的共同通路，是AD 形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。Aβ 主要有2種形式，一種是由40 個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白片段，稱之為Aβ40，另一種是由42 ～43 個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白片段，稱為Aβ42。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ42比Aβ40多2 個(gè)疏水性氨基酸而具有更高的凝聚能力，更容易在AD 患者的腦中形成SP。

1.1.1 腦脊液中的Aβ 早期對(duì)Aβ40的定量檢測(cè)結(jié)果并不理想，大部分研究顯示，AD 患者腦脊液中Aβ40的水平往往不變或輕度升高［1]。另有研究表明，由于Aβ 寡聚化造成的抗原表位被掩蓋或Aβ 結(jié)合了載體蛋白，導(dǎo)致ELISA 等方法無(wú)法檢測(cè)到Aβ40水平的真實(shí)變化，只有使用金屬離子親和層析法才能檢測(cè)到腦脊液中Aβ40水平的顯著升高［2]。

大多數(shù)研究表明，與健康對(duì)照組相比，AD 患者早期腦脊液中Aβ42濃度降低約50%，甚至在MCI 階段就可以見(jiàn)到Aβ42濃度的降低，因此，對(duì)AD 患者進(jìn)行腦脊液Aβ42定量檢測(cè)有助于AD 的早期診斷［3]。雖然腦脊液中Aβ42水平的降低可以將AD 患者與健康對(duì)照組正確區(qū)分開(kāi)，但是，Aβ42水平的降低并不能將AD 與腦內(nèi)具有Aβ 沉積的其他疾病區(qū)分開(kāi)，如路易體癡呆、額顳葉癡呆和血管性癡呆等［4]。因此，將Aβ42作為AD 生物標(biāo)志物，其特異性并不高。腦脊液中Aβ42水平降低的確切原因尚有待于進(jìn)一步研究。

研究證實(shí)，AD 或MCI 患者腦脊液中Aβ40/Aβ42的比值較健康對(duì)照組明顯升高，該指標(biāo)與上述AD患者早期腦脊液Aβ42濃度降低約50%聯(lián)合應(yīng)用可以將AD 和非AD 型癡呆很好地鑒別開(kāi)，對(duì)AD 的早期診斷更具有臨床價(jià)值。Kanai 等［5]和Wiltfang等［6]研究也都證實(shí)了這一結(jié)論，即在預(yù)測(cè)MCI 發(fā)展成為AD 方面，Aβ40/Aβ42的比值比單獨(dú)檢測(cè)Aβ42水平更有意義。

1.1.2 血液中的Aβ 由于血液標(biāo)本易采集，故針對(duì)血液中AD 的生物標(biāo)志物研究較多。對(duì)于AD 患者血漿中Aβ40和Aβ42水平的檢測(cè)，其結(jié)果也不盡相同。部分研究發(fā)現(xiàn)，AD 患者血漿Aβ40水平顯著高于對(duì)照組［7];另有研究表明，在臨床前期，AD 患者血漿中Aβ42濃度明顯降低［8];然而，大多數(shù)研究表明，AD 患者早期階段血漿中Aβ40和Aβ42并無(wú)明顯變化，故血漿Aβ40和Aβ42水平的檢測(cè)對(duì)AD 的早期診斷并無(wú)意義［9]。彭丹濤等［10]研究證實(shí)，家族性AD 患者血漿Aβ42水平較對(duì)照組顯著升高，隨著疾病的進(jìn)展，Aβ42水平逐漸降低，因此，Aβ42水平的變化要早于臨床癥狀的發(fā)生;而血漿中Aβ40水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同可能與血漿中Aβ 水平較低、影響血漿Aβ 代謝的肝腎功能及影響血漿Aβ 來(lái)源的外周組織(如骨骼肌可產(chǎn)生Aβ)有關(guān)。因此，血液中Aβ 水平作為AD早期診斷的生物標(biāo)志物缺乏足夠的穩(wěn)定性和可靠性，對(duì)AD 的臨床診斷缺乏應(yīng)用價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，由Aβ42聚集形成的可溶性Aβ 寡聚體是產(chǎn)生神經(jīng)毒性的主要形式［11]。Aβ 寡聚體能夠特異地與某些突觸相結(jié)合，進(jìn)而引起突觸結(jié)構(gòu)損傷和認(rèn)知功能障礙。值得注意的是，這種損害在AD 的早期階段就已經(jīng)出現(xiàn)，因此，對(duì)可溶性Aβ 寡聚體的檢測(cè)可能更具有臨床診斷意義。

鑒于AD 患者腦內(nèi)有Aβ 的沉積，推測(cè)AD 患者可能存在清除Aβ 的免疫缺陷，因此，針對(duì)抗Aβ 自身抗體也有大量的研究。研究顯示，AD 患者血清中抗Aβ 自身抗體的水平較健康對(duì)照組明顯升高［12-13]。Marcello 等［14]分析AD 患者與健康對(duì)照組外周血中不同Aβ 亞型(Aβ1-42、Aβx-40、Aβx-42和AβpE3)的抗Aβ 抗體，結(jié)果顯示，兩組除抗AβpE3 抗體有差異外，其他并無(wú)明顯差異。另有研究發(fā)現(xiàn)，抗Aβ 寡聚體抗體在中重度患者中的水平顯著高于輕度AD 患者［15]，提示其可用于AD 疾病進(jìn)程的診斷。目前，關(guān)于AD 患者血漿中抗Aβ 自身抗體的變化仍有爭(zhēng)議，仍需更深入地進(jìn)行研究。

1.1.3 血小板中的APP 在血小板中，完整的APP被加工成3種異構(gòu)體，相對(duì)分子質(zhì)量分別為130000、110000和106000。研究顯示，APP 異構(gòu)體的代謝變化與AD 的發(fā)病過(guò)程有著重要相關(guān)性［16]。Mukaetova-Ladinska 等［17]對(duì)血小板中的APP 進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其含量與認(rèn)知程度呈負(fù)相關(guān)。高分子量的APP 異構(gòu)體(130000)與低分子質(zhì)量的異構(gòu)體(110000 與106000 之和)的比值稱為APP 異構(gòu)體比值。研究表明，AD 患者血小板中該比值低于健康對(duì)照組，并且與疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)程存在著一定的關(guān)聯(lián)，該比值可以作為AD 的有效生物標(biāo)志物［18-19]。

1.2 tau 蛋白

tau 蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，起到促進(jìn)微管形成、穩(wěn)定神經(jīng)元的作用。在AD 患者腦內(nèi)，tau 蛋白發(fā)生異常磷酸化、糖基化后形成配對(duì)螺旋纖維(paired helical filaments，PHFs)，進(jìn)一步形成NFTs。

在NFTs 形成早期，總tau 蛋白(total tau proteins，t-tau)和水溶性磷酸化tau 蛋白(phosphorylated tau proteins，p-tau)可以通過(guò)病變神經(jīng)元的細(xì)胞膜進(jìn)入腦脊液中。研究顯示，中重度AD 患者腦脊液中t-tau 水平較健康對(duì)照組高2 ～3 倍［20];雖有研究發(fā)現(xiàn)t-tau 升高水平與疾病進(jìn)程無(wú)關(guān)，但在AD 發(fā)病早期就檢測(cè)到t-tau 的升高［21-22]，因此，t-tau 可以用于AD 的預(yù)測(cè)。然而Gloeckner 等［23]對(duì)106例包括AD、皮質(zhì)-脊髓-紋狀體變性、Lewy 癡呆、額顳葉癡呆以及正常壓力腦積水及健康對(duì)照組腦脊液中t-tau 蛋白進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，所有受試者腦脊液中t-tau 水平都顯著增高，因此，t-tau 單獨(dú)用于AD 的診斷尚缺乏特異性，不能作為區(qū)分其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的特異性生物標(biāo)志物。

P-tau 是形成NFTs 的主要物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者體內(nèi)tau 蛋白至少有25 個(gè)異常磷酸化位點(diǎn)［24]，這些位點(diǎn)主要位于與微管結(jié)合的181-235 和369-422氨基酸位點(diǎn)。因此，過(guò)度磷酸化易導(dǎo)致tau蛋白與微管結(jié)合能力下降。目前研究較多的是p-tau 181、p-tau 199 以及p-tau 231，這三者的水平均高于健康對(duì)照組，而且分別能很好地鑒別AD 與皮質(zhì)-脊髓-紋狀體變性、Lewy 癡呆與額顳葉癡呆。其中，p-tau 231 鑒別AD 與其他癡呆類型的靈敏度和特異性高達(dá)85%和97%［25]。另有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于急性腦血管病等非特異性腦損傷患者，t-tau 含量升高，但p-tau 含量并未升高，這更說(shuō)明p-tau 具有特異性。對(duì)AD 和其他癡呆疾病的診斷，p-tau 具有較高的靈敏度和特異性。

1.3 載脂蛋白

1.3.1 載脂蛋白E(ApoE) ApoE 是一種與膽固醇類物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)的血漿蛋白，主要在肝臟合成和分泌，其次在大腦。ApoE基因具有多態(tài)性和遺傳上的異質(zhì)性，它在同一基因位點(diǎn)上有3 個(gè)等位基因:ε2、ε3和ε4;分別編碼3種蛋白:ApoE2、ApoE3 和ApoE4，其中，ApoE4 最不穩(wěn)定，具有很高的致病活性。研究發(fā)現(xiàn)，ApoE 與家族性AD 和散發(fā)性AD 均有很大關(guān)聯(lián)，ε4能夠提高患AD 的風(fēng)險(xiǎn);同時(shí)在SP和NFTs 中均含有ApoE4，并且與Aβ 的結(jié)合能力明顯強(qiáng)于ApoE2 和ApoE3。Ma 等［26]研究發(fā)現(xiàn)，ApoE在與Aβ 相互作用的過(guò)程中，ApoE4 比ApoE3 更能促進(jìn)NFTs 的形成，而ApoE2 能夠有效地預(yù)防Aβ 的聚集。Fagan 等［27]研究表明，ApoE4 不是導(dǎo)致Aβ沉積的必要因素，但能夠促進(jìn)可溶性Aβ 形成沉淀。目前，關(guān)于ApoE 與Aβ 的作用機(jī)制尚不清楚，但值得肯定的是，ApoE 與Aβ 的產(chǎn)生存在著很大關(guān)聯(lián)。現(xiàn)在普遍認(rèn)為ApoE4 與Aβ 共沉淀，加速了Aβ 的聚集，提高了患AD 的風(fēng)險(xiǎn);而ApoE2、ApoE3 可以抑制Aβ 的聚集，起保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，ApoE3 能夠與未被磷酸化的tau 蛋白結(jié)合，從而防止tau 蛋白的過(guò)度磷酸化;然而ApoE4 與tau 蛋白的親和力較差，不能防止tau 蛋白的過(guò)度磷酸化［28]，致其形成雙螺旋絲，隨后發(fā)展為NFTs，最終引起AD 的發(fā)生。Hoe 等［29]研究證明了類似結(jié)論:ApoE2 能夠降低tau 蛋白的磷酸化，而ApoE4 則促進(jìn)tau 蛋白的磷酸化。由于AD 患者ApoE4 升高且具有較高的特異性，隨著研究的深入，ApoE4 將成為一種用于AD 診斷的重要的生物標(biāo)志物。

1.3.2 載脂蛋白J(ApoJ) ApoJ 又稱簇集蛋白，在血漿中含量較多。血漿ApoJ 水平與AD 存在相關(guān)性。研究［30-31]發(fā)現(xiàn)，血漿ApoJ 含量高的AD 患者，其嗅皮質(zhì)、顳上回萎縮速度明顯減慢;也有研究發(fā)現(xiàn)，血漿ApoJ 值與內(nèi)嗅皮質(zhì)(特別是右側(cè)內(nèi)嗅皮質(zhì))Aβ 呈顯著負(fù)相關(guān)。ApoJ 可能通過(guò)某種途徑或機(jī)制對(duì)AD 的病理生理進(jìn)程起到保護(hù)作用。上述研究均揭示ApoJ 作為一種AD 生物標(biāo)志物的巨大潛能。

1.4 炎癥性的生物標(biāo)志物

炎癥反應(yīng)在AD 的發(fā)病中起著重要作用。研究表明，AD 患者外周血中的白細(xì)胞介素(interleukin，IL)1、4、6、10、12、16 和18，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)與健康對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尤其是IL-6、10、12、18，TNF-α 和TGF-β 的水平均升高［32]。另有研究發(fā)現(xiàn)，伴有嚴(yán)重的認(rèn)知功能損害的AD 患者，其血漿中TNF-α 的水平較低［33]。研究發(fā)現(xiàn)，AD 患者TNF-α 受體TNFR1 血清水平明顯高于健康對(duì)照組［34]。因此，與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子對(duì)AD 的診斷及預(yù)防可能具有一定的指導(dǎo)意義。

1.5 生物學(xué)上的功能性金屬

金屬離子內(nèi)部穩(wěn)態(tài)的紊亂與AD 等幾種神經(jīng)性病變有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在AD 患者大腦內(nèi)的Aβ 沉淀中，鋅、銅、鐵的含量較高。AD 患者血清中鋅濃度顯著低于健康對(duì)照組，而鐵和銅濃度沒(méi)有顯著的差異［33]。推測(cè)可能是由于鋅與AD 患者大腦中的Aβ和(或)APP 相結(jié)合而致其在血清中的水平下降。盡管如此，目前關(guān)于AD 患者血清中生物金屬濃度改變的觀點(diǎn)尚未達(dá)成一致，仍需要進(jìn)一步的研究。

1.6 晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，AD 發(fā)病機(jī)制與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常密切相關(guān)，而且糖尿病患者較健康人更易患AD;因此，相關(guān)的AD 生物標(biāo)志物也不斷地被發(fā)現(xiàn)。AGEs 是一種具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，隨著病程的發(fā)展在糖尿病患者體內(nèi)不斷堆積，在AD 患者的SP 和NFTs 中均能檢測(cè)到。AGEs 與AD 的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，參與了AD 的病理形成，最終導(dǎo)致神經(jīng)元壞死;因此，AGEs 可能成為用于AD 早期臨床診斷的生物標(biāo)志物。

1.7 阿爾茨海默病相關(guān)神經(jīng)絲蛋白(Alzheimer-associated neuronal thread protein，AD7c-NTP)

AD7c-NTP 是一種跨膜磷蛋白，可能成為AD 早期臨床診斷的生物標(biāo)志物之一。在AD 患者的腦脊液和尿液中均可檢測(cè)到AD7c-NTP，并且其水平的高低與癡呆的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而與年齡和性別無(wú)關(guān)［35]。研究表明，AD 患者腦脊液和尿液中的AD7c-NTP 水平明顯高于健康對(duì)照組［36-37]，并且中晚期AD 患者AD7c-NTP 水平要明顯高于早期AD患者［37]。鑒于AD7c-NTP 在早期AD 患者的腦脊液和尿液中均表現(xiàn)為升高，且尿液檢測(cè)無(wú)創(chuàng)、方便，因此，檢測(cè)AD 患者尿液中的AD7c-NTP 水平具有診斷早期AD 的臨床應(yīng)用價(jià)值。

2 其他AD 相關(guān)生物標(biāo)志物

除上述生物標(biāo)志物外，還有大量關(guān)于AD 生物標(biāo)志物的報(bào)道:①異前列腺素(8，12-iso-iPF2α-VI isoprostane，IP)是脂膜氧化損傷產(chǎn)生的物質(zhì)，在MCI 和AD 患 者 的 腦 脊 液 中 呈 高 表 達(dá)［38-39];與Aβ1-42、p-tau 相比，IP 是唯一隨著隨訪時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)水平增高的標(biāo)志物。②研究發(fā)現(xiàn)，MCI 和AD 患者的腦脊液中β-位點(diǎn)淀粉樣蛋白前體蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1，BACE1)的濃度和活性較健康對(duì)照明顯升高。BACE1 是促使APP 裂解成Aβ 最主要的β-分泌酶，其活性與腦脊液中t-tau 蛋白水平呈正相關(guān)［40]。③近來(lái)研究顯示，miRNA 在神經(jīng)退行性疾病中起著重要作用，如BACE1 基因的miRNA-29a/b-1 在AD中的表達(dá)明顯降低，其缺失使BACE1 蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，最終導(dǎo)致Aβ 的積累，直至引發(fā)AD［41]。隨著進(jìn)一步研究，miRNA 有可能成為AD 診斷的生物標(biāo)志物之一。④蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的發(fā)展，為尋找AD 血液的生物標(biāo)志物提供了巨大的幫助，相關(guān)的異常物質(zhì)如表皮生長(zhǎng)因子、溶血磷脂酰膽堿、色氨酸等相繼被發(fā)現(xiàn)。由于各實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)存在著很大差異，且這些標(biāo)志物與AD 的病理生理關(guān)系還需進(jìn)一步明確;因此，上述具有潛在應(yīng)用價(jià)值的標(biāo)志物應(yīng)用于臨床診斷還需要更深入的研究。

3 總結(jié)與展望

關(guān)于AD 早期診斷的體液生物標(biāo)志物的研究已有很多，但迄今尚未發(fā)現(xiàn)一種確定的、可靠的生物標(biāo)志物。腦脊液中Aβ 以及tau 蛋白的研究已取得了較大的成就，對(duì)AD 的臨床診斷具有一定的應(yīng)用價(jià)值。但是，腦脊液的采集對(duì)患者會(huì)造成一定的創(chuàng)傷，而且采集的適應(yīng)證、禁忌證以及技術(shù)性都限制了腰椎穿刺的廣泛應(yīng)用。由于血液采集創(chuàng)傷較小、簡(jiǎn)單易操作，因此，對(duì)血液中AD 生物標(biāo)志物的研究更具有臨床意義。

尋找一種能及早、準(zhǔn)確地檢測(cè)到AD 的特異性分子病理學(xué)改變的生物標(biāo)志物，還需要更深入的研究。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的發(fā)展，以及對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞的深入研究，我們將會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的與AD 相關(guān)的基因及其功能蛋白，進(jìn)而開(kāi)發(fā)出具有高靈敏度和高特異性的生物標(biāo)志物。

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