大劑量沖擊法建立膠質(zhì)瘤耐替莫唑胺細(xì)胞株及生物學(xué)鑒定

向定朝，王存祖，陸曉峰，歐陽(yáng)琦

(1.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212001;2.蘇北人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 揚(yáng)州225001;3.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

膠質(zhì)瘤一直是神經(jīng)外科領(lǐng)域的治療難題，化療是膠質(zhì)瘤術(shù)后重要治療方法之一。目前國(guó)際上公認(rèn)的膠質(zhì)瘤化療首選藥物是替莫唑胺(temozolomide，TMZ)［1]，但研究顯示替莫唑胺也僅能小幅延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，因膠質(zhì)瘤耐藥而不能改善其預(yù)后。膠質(zhì)瘤化療耐藥，是膠質(zhì)瘤化療失敗和膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的原因。近年來(lái)“腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)”認(rèn)為，從膠質(zhì)瘤中分離出來(lái)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells，GSCs)具有較強(qiáng)的耐藥性，是膠質(zhì)瘤耐藥以及復(fù)發(fā)的根本原因。為深入了解膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺耐藥的原因，體外構(gòu)建人腦膠質(zhì)瘤耐替莫唑胺U251 細(xì)胞株(U251/TMZ)，是研究膠質(zhì)瘤耐藥的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大劑量沖擊法［2]建立膠質(zhì)瘤耐替莫唑胺細(xì)胞模型，并比較U251/TMZ 與親代細(xì)胞U251 之間的生物學(xué)特征。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞株購(gòu)于上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù);培養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的特級(jí)胎牛血清、DMEM 低糖培養(yǎng)基、DMSO、胰酶、青鏈雙抗等購(gòu)于Gibco 公司;CD133、ABCG2 鼠抗人單抗購(gòu)于Neo-Markers 公司;CD133(AC133)、羊抗鼠IgG(二抗)、CY3等均購(gòu)于Miltenyi 公司;ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于Merck Millipore 公司;TMZ、噻唑鹽(MTT)等購(gòu)于Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)U251 細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃，5%CO2)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底壁時(shí)進(jìn)行消化、傳代。

1.2.2 藥物大劑量沖擊法建立U251/TMZ 細(xì)胞細(xì)胞接種于75 mL 玻璃培養(yǎng)瓶中，貼壁生長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)瓶底時(shí)，參考我們前期實(shí)驗(yàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)［3]，加入120 μmol/L 的TMZ 進(jìn)行誘導(dǎo)。常規(guī)條件下培養(yǎng)72 h，棄含藥培養(yǎng)液，PBS 洗2 次，加正常培養(yǎng)液，此后1 ～2 天換液1 次，以清除死亡的漂浮細(xì)胞。待存活下來(lái)的細(xì)胞恢復(fù)了生長(zhǎng)增殖能力并形成較大的細(xì)胞克隆(＞100 個(gè)細(xì)胞)時(shí)，胰酶消化，接種至25 mL的玻璃培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞增殖到足夠數(shù)量時(shí)，再接種于75 mL 玻璃培養(yǎng)瓶中，按上法再次篩選。培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)間約5 個(gè)月，平均每月可篩選1 ～2次。把實(shí)驗(yàn)最后所獲得的細(xì)胞作為耐藥細(xì)胞，并命名為U251/TMZ。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)藥物敏感性 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5 ×104/mL，接種至96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h 后加入含不同濃度TMZ 的培養(yǎng)基。TMZ 設(shè)6 個(gè)試驗(yàn)濃度，即10，50，100，200，500，1000 μmol/L 和一個(gè)空白對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，每孔加入0.5% MTT 20 μL，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，PBS 小心沖洗3 次后，加入DMSO 150 μL，震蕩均勻后酶標(biāo)儀檢測(cè)，設(shè)定波長(zhǎng)為540 nm 測(cè)定每孔的光密度(D)值。采用SPSS 軟件的Probit 程序計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)，耐藥指數(shù)(resistance index，RI)=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖曲線(xiàn)繪制 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，將U251/TMZ 和親代細(xì)胞懸液(1 ×104個(gè)/mL)分別接種至6 孔板中，不同細(xì)胞設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，每孔接種1 mL，分別于接種后每間隔24 h 計(jì)數(shù)1 次，連續(xù)觀察1 周。每次計(jì)數(shù)取3 個(gè)復(fù)孔細(xì)胞數(shù)的平均值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)CD133 表達(dá) 細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)好后(約12 h)，用4%低聚甲醛固定，3% BSA 4 ℃封閉30 min，加入CD133一抗，放入4 ℃冰箱過(guò)夜。第2 天用PBS 漂洗3 次后，加入帶CY3熒光標(biāo)記的二抗，37 ℃水浴箱溫?zé)? h，經(jīng)Hoechst 33342 復(fù)染后，PBS 漂洗3 次，置熒光顯微鏡下觀察并攝片。

陽(yáng)性細(xì)胞判斷:CD133 陽(yáng)性為細(xì)胞膜出現(xiàn)紅色熒光，Hoechst 33342 復(fù)染后，陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核出現(xiàn)藍(lán)色熒光。結(jié)果分析:置于高倍鏡下觀察，每孔隨機(jī)取3 個(gè)不同視野拍照，采用ImageJ 軟件計(jì)算細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。陽(yáng)性細(xì)胞率=CD133 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/Hoechst 33342 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ABCG2 蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251/TMZ 和親代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1 ×106個(gè)/mL，分別接種于6 孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞并提取總蛋白。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，按12 μg 上樣加入凝膠孔中，開(kāi)始SDS-PAGE 凝膠電泳。電泳結(jié)束后，使用半干膜法轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入ABCG2 一抗4 ℃孵育過(guò)夜后，洗滌3 次，每次10 min，二抗室溫孵育2 h 洗滌3 次，每次10 min，使用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，通過(guò)CCD 凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，采用Lane1D 軟件分析條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，成組資料比較采用兩樣本t檢驗(yàn);以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建U251/TMZ 細(xì)胞株

在早期加入TMZ 后，大量U251 細(xì)胞死亡。經(jīng)過(guò)約3 個(gè)周期培養(yǎng)后，細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生，再次加入TMZ后細(xì)胞死亡數(shù)目逐漸減少。約經(jīng)過(guò)5 個(gè)月的培養(yǎng)，獲得相對(duì)穩(wěn)定的膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞株U251/TMZ。顯微鏡下觀察，親代膠質(zhì)瘤細(xì)胞多為梭形，大小均勻，邊界清楚，貼壁生長(zhǎng)。耐藥細(xì)胞株大部分貼壁形態(tài)相似，異形性不顯著，有少部分細(xì)胞變形，并有巨細(xì)胞產(chǎn)生。和親代細(xì)胞株相比，細(xì)胞輪廓更清晰。見(jiàn)圖1。

圖1 耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的形態(tài)變化(×100)Fig 1 Morphological changes of temozolomide resistant glioma cell line

2.2 U251/TMZ 對(duì)替莫唑胺的敏感性變化

使用不同濃度梯度的TMZ 作用于U251/TMZ 和親代細(xì)胞，采用SPSS 的Probit 程序計(jì)算IC50，結(jié)果親代細(xì)胞的IC50為(35.62 ±2.97)μmol/L，U251/TMZ的IC50為(286.76 ±8.36)μmol/L，U251/TMZ 是親代細(xì)胞的8.1 倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-63.28，P=0.00)。

2.3 細(xì)胞增殖倍增的改變

U251/TMZ 和親代細(xì)胞以相同數(shù)量接種后，于第3 天可以觀察到兩種細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯不一樣，親代細(xì)胞第3 天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而U251/TMZ 生長(zhǎng)緩慢，第4 天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且生長(zhǎng)曲線(xiàn)的斜率也減小，表明耐藥細(xì)胞較親代細(xì)胞增殖減慢，倍增時(shí)間增加。見(jiàn)圖2。

圖2 U251/TMZ 與親代U251 細(xì)胞增殖曲線(xiàn)Fig 2 Proliferation curve of U251/TMZ and U251 cell

2.4 U251/TMZ 細(xì)胞CD133 的表達(dá)

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，親代細(xì)胞中CD133 陽(yáng)性率為(3.9 ±0.99)%，U251/TMZ 中CD133 陽(yáng)性率為(65.3 ±4.16)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=45.35，P=0.00)。

2.5 U251/TMZ 細(xì)胞ABCG2 蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果見(jiàn)圖3，定量分析顯示U251/TMZ 細(xì)胞ABCG2 蛋白的相對(duì)表達(dá)量為(71.3 ±25.8)，明顯高于親代細(xì)胞的(0.11 ±0.3)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.19，P＜0.00)。

圖3 U251 及U251/TMZ 細(xì)胞ABCG2 的表達(dá)Fig 3 ABCG2 expression of U251 and U251/TMZ cell

3 討論

3.1 膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞的培養(yǎng)

在體外建立耐藥細(xì)胞株的常用方法為藥物濃度連續(xù)遞增法和大劑量沖擊法［4]。這兩種方法建立的細(xì)胞模型在生物學(xué)特性及形態(tài)結(jié)構(gòu)方面有很大差別。濃度梯度遞增法建立的細(xì)胞模型是通過(guò)化療藥物逐漸緩慢增加濃度而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生獲得性耐藥，這種方法獲得的耐藥性很高，細(xì)胞的形態(tài)及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)常常發(fā)生很大的變化。大劑量沖擊法是通過(guò)化療藥物大劑量、短時(shí)間內(nèi)作用于細(xì)胞，從而篩選出本身就具有較強(qiáng)耐藥性的細(xì)胞。大劑量沖擊法的給藥過(guò)程與臨床化療過(guò)程中的給藥方法非常接近。目前認(rèn)為通過(guò)大劑量沖擊法建立膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞模型，比較符合臨床耐藥實(shí)際［5]。為了減少臨床化療的不良反應(yīng)，提高療效，臨床上常常大劑量短程給藥，使藥物濃度迅速地達(dá)到較高的血峰濃度，持續(xù)數(shù)天后停藥，間隔一段時(shí)間后再行第2 次化療。該模型與臨床化療耐藥產(chǎn)生的過(guò)程相似，有助于研究臨床耐藥的原因。本研究采用大劑量沖擊法成功建立膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞株，其生物學(xué)特征有明顯的改變，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，增殖倍增時(shí)間延長(zhǎng)。

3.2 U251/TMZ 耐藥性的改變

多藥耐藥是惡性腫瘤的一種特殊生物學(xué)特征，是指惡性腫瘤細(xì)胞接觸一種抗癌藥后，繼而對(duì)多種結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制各異的其他抗癌藥產(chǎn)生耐藥性。ABCG2 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一種與腫瘤多藥耐藥有關(guān)的新的藥物排出泵，具有維持干細(xì)胞穩(wěn)定性、維持組織細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)等生理功能，在低氧環(huán)境中ABCG2 的上調(diào)可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抗藥性。ABCG2 通過(guò)結(jié)合和水解ATP 并利用能量，能轉(zhuǎn)運(yùn)多種化療藥物，把具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用于細(xì)胞內(nèi)不同位置靶點(diǎn)的化療藥物泵出胞外，從而使腫瘤對(duì)多種抗癌藥物產(chǎn)生抗藥性，其表達(dá)特性與惡性腫瘤化療效果有密切關(guān)系，高表達(dá)者化療效果不佳，而低表達(dá)則療效較好。本研究結(jié)果表明，U251/TMZ 細(xì)胞ABCG2的表達(dá)比親代細(xì)胞顯著增加，說(shuō)明其耐藥性顯著性增加。U251/TMZ 的這種獲得性耐藥使得膠質(zhì)瘤的治療具有多變性、復(fù)雜性。

3.3 膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞與干細(xì)胞存在相關(guān)性

GSCs 是維持膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展以及復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素［6]，腫瘤干細(xì)胞是膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐藥的主體細(xì)胞。而以往的觀點(diǎn)認(rèn)為，膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的根源。那么能否認(rèn)為GSCs 與膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞就是同一類(lèi)細(xì)胞呢?在本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)了U251/TMZ 細(xì)胞CD133 表達(dá)情況，結(jié)果U251/TMZ 細(xì)胞CD133 陽(yáng)性率顯著高于親代細(xì)胞，即有較多耐藥細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞的特征，而不是所有的耐藥細(xì)胞都表達(dá)干細(xì)胞特征。為此，我們認(rèn)為膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞與GSCs 之間存在一定相關(guān)性，兩者并不是同一類(lèi)細(xì)胞。這也預(yù)示了腫瘤化療的復(fù)雜性，膠質(zhì)瘤化療耐藥呈現(xiàn)為十分復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，具有多機(jī)制、多因素的特點(diǎn)［7-8]。膠質(zhì)瘤的先天性耐藥和這種獲得性化療耐藥是導(dǎo)致化療復(fù)雜的根本原因。

綜上所述，通過(guò)大劑量沖擊法構(gòu)建的耐藥細(xì)胞株具有耐藥性，所獲得的耐藥細(xì)胞株中有大量的細(xì)胞具有膠質(zhì)瘤干細(xì)胞特性，提示膠質(zhì)瘤化療具有復(fù)雜多變性。

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