慢性髓系白血病PDLIM4 基因表達(dá)與其啟動子甲基化水平的關(guān)系

李云，錢軍，陳芹，姚冬明，王翠竹，柴海彥，楊靜，林江，馬吉春，陳星星，馬玉娟

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院1.血液科，2.中心實驗室，江蘇 鎮(zhèn)江212002)

慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性骨髓增殖性疾病。根據(jù)疾病發(fā)展的過程，分為慢性期、加速期以及急變期。CML 的發(fā)病與BCR/ABL易位引起的酪氨酸激酶異常激活密切相關(guān)［1]。PDLIM4 基因(PDZ and LIMdomain 4 gene)，又稱RIL(reversion-induced LIM)基因，是定位于染色體5q31.1 的抑癌基因［2]，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡［3-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)PDLIM4 基因啟動子甲基化與CML 疾病進(jìn)展和伊馬替尼耐藥相關(guān)，且是CML 患者的一個不良預(yù)后因素［1]。我們應(yīng)用實時定量PCR(RQ-PCR)及實時定量甲基化特異性PCR(RQ-MSP)技術(shù)檢測了中國CML 患者PDLIM4 基因轉(zhuǎn)錄本及啟動子甲基化水平，并探討其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 病例

59例CML 患者均來自于我院門診和住院部，均按文獻(xiàn)［6]方法進(jìn)行診斷和分期，均通過染色體和(或)融合基因檢測證實。檢測PDLIM4 表達(dá)和啟動子甲基化狀態(tài)的對照組均為特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)患者，病例數(shù)分別為21例和24例。

其中，用于檢測PDLIM4 基因表達(dá)的36例標(biāo)本包括33例慢性期及3例急變期患者。共有60例樣本用于檢測PDLIM4 基因啟動子甲基化狀態(tài)，其中59例初發(fā)(慢性期44例，加速期6例，急變期9例)，1例為經(jīng)治療隨訪患者的標(biāo)本。

1.2 主要試劑與儀器

淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)購自上海試劑二廠;Trizol購自美國Invitrogen 公司;Evagreen 染料購自Biotium 公司;MMLV 及TaqDNA 聚合酶購自美國Fermentas 公司;基因組DNA 提取試劑盒為美國Gentra公司產(chǎn)品;pMD?19T 克隆載體為TaKaRa 公司產(chǎn)品;凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒DNA 小量試劑盒購自Axygen公司;DNA 甲基化修飾試劑盒EpiTech Bisulfite Kits購自德國QIAGEN 公司;引物均由生工生物(上海)有限公司合成。主要實驗器材為ABI 公司的7300 定量PCR 儀，Bio-Rad 公司的iCycler 梯度PCR 儀以及Syngene 公司的Gene Genius 凝膠成像儀。

1.3 骨髓單個核細(xì)胞(BMNC)分離和總RNA、基因組DNA 制備

抽取患者及對照組骨髓10 mL，經(jīng)肝素抗凝，通過Ficoll 液離心分離BMNC，取一部分用生理鹽水洗滌后加入細(xì)胞裂解液Trizol，按常規(guī)操作進(jìn)行RNA 提取及相應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA 貯存于-20 ℃?zhèn)溆?。另取BMNC，按試劑盒說明書提取基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度儀測光密度值來確定DNA 含量和純度，立即硫化修飾處理或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA 亞硫酸鹽修飾

每份病例樣本取1 μg DNA，依照DNA 甲基化修飾試劑盒說明書嚴(yán)格操作，將已完成亞硫酸氫鹽修飾處理的標(biāo)本置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PDLIM4 基因表達(dá)的檢測

應(yīng)用Primer Express 2.0 軟件(美國ABI 公司)設(shè)計RQ-PCR 引物(表1)。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，選擇ABL及ALU分別作為檢測PDLIM4表達(dá)、甲基化的內(nèi)參基因［7-8]。

表1 PDLIM4 基因RQ-PCR 與RQ-MSP 引物序列Tab 1 The primer sequences of PDLIM4 gene for RQ-PCR and RQ-MSP

25 μL RQ-PCR 反應(yīng)體系包含dNTP 0.2 mmol/L，MgCl24 mmol/L、引物0.4 μmol/L、1 ×EvaGreen、1 ×Rox、1.0 UTaqDNA 以及50 ng cDNA。反應(yīng)條件:94 ℃4 min 預(yù)變性，然后95 ℃變性30 s、62 ℃(ABL 為60 ℃)退火30 s、72 ℃延伸30 s，50 個循環(huán)擴(kuò)增后再72 ℃延伸7 min，PCR 熒光收集設(shè)為84 ℃30 s。熔解曲線程序為95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，60 ℃15 s。每次PCR 擴(kuò)增均設(shè)立PDLIM4 質(zhì)粒為模板的陽性對照和無菌水為模板的空白對照。用30 g/L 瓊脂糖凝膠80 V 電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，1 h 后在Gene Genius 凝膠成像儀上顯像并拍照。

1.6 PDLIM4 基因甲基化檢測

應(yīng)用Methyl Primer Express v1.0(美國ABI 公司)設(shè)計引物(表1)。2 μL 修飾的DNA 作為RQMSP 模板，其余體系同RQ-PCR。PCR 循環(huán)反應(yīng)及熔解曲線的條件同前述，更改退火溫度(M 62 ℃、U 58 ℃和ALU62 ℃)。

1.7 PCR 產(chǎn)物克隆測序

將PDLIM4 表達(dá)、M、U 以及ABL、ALU陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)由生工生物(上海)有限公司克隆測序，驗證所得序列。

1.8 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查

運用直接法及24 h 短期培養(yǎng)法，將采集的骨髓細(xì)胞制備成染色體標(biāo)本，進(jìn)行R 顯帶后按照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN)》做核型分析。

1.9 分析方法

PDLIM4 標(biāo)準(zhǔn)化的比率按照公式NPDLIM4=(EPDLIM4)△CT÷(EABL)△CT進(jìn)行計算。擴(kuò)增效率E =10(-1/slope)(Slope 指標(biāo)準(zhǔn)曲線中CT-cDNA 濃度擴(kuò)增圖的斜率);△CT 指對照標(biāo)本和被檢測標(biāo)本CT 值之間的差值;對照標(biāo)本中，PDLIM4 和ABL △CT 最小的1例被選作參照標(biāo)本，并且認(rèn)為其表達(dá)水平為100%。

PDLIM4 基因啟動子甲基化相對定量的計算方法同表達(dá)的一致，但需將PDLIM4 表達(dá)的CT 值替換成甲基化的CT 值，內(nèi)參變?yōu)锳LU;選擇對照組中PDLIM4 和ALU △CT 最小的為參照標(biāo)本，視作啟動子100%甲基化。

1.10 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件做統(tǒng)計學(xué)分析。用Mann-Whitney U 檢驗分析對照組和CML 組以及CML 不同分期間PDLIM4 表達(dá)/甲基化相對含量及臨床資料的差異;用Pearson＇s χ2檢驗或者Fisher＇s 確切概率法分析不同組間PDLIM4 低表達(dá)/高甲基化頻率的差異;采用Spearman 秩相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。所有分析設(shè)定P值為雙側(cè)分布，并以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CML 患者中PDLIM4 的表達(dá)狀況

21例對照中均能檢測到PDLIM4 表達(dá)，范圍0.16 ～1. 00(中位0. 40)。選擇低于0. 06(即均數(shù)-1.5標(biāo)準(zhǔn)差)作為PDLIM4 基因低表達(dá)的閾值。36例CML 患者中PDLIM4 表達(dá)水平為0.00 ～5.77(中位0.25)，其中8例(22%)呈低表達(dá)，低表達(dá)率與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher＇s 確切概率法，P=0.021)。CML 患者中PDLIM4 表達(dá)水平和bcr/abl融合基因轉(zhuǎn)錄本水平正相關(guān)(r= 0.434，P=0.043)，與年齡、性別、血紅蛋白量、外周血白細(xì)胞計數(shù)及血小板計數(shù)均無相關(guān)性(P＞0.05)，但核型分組間低表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.996，P=0.010)(表2)。3例急變期患者中PDLIM4 均為低表達(dá)，而其余33例慢性期患者中僅5例為低表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008)。

2.2 CML 患者PDLIM4 基因啟動子甲基化水平

24例對照的甲基化水平為0 ～1.0145(中位0.06)，選擇≥1.22(即對照組平均值+3 倍標(biāo)準(zhǔn)差)作為確定PDLIM4 高甲基化陽性。59例CML 中13例(22%)出現(xiàn)PDLIM4 高甲基化，而24例對照未顯示高甲基化，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher＇s 確切概率法，P=0.016)。選擇M、U 陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，測序結(jié)果如圖1 所示。

PDLIM4 甲基化狀態(tài)與CML 患者的年齡、性別、外周血白細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計數(shù)及bcr/abl含量均無相關(guān)性;核型分組間PDLIM4 高甲基化率也不存在統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.148)，見表3。

2.3 不同分期CML 患者PDLIM4 甲基化水平的變化

59例CML 患者中，16%(7/44)慢性期、33%(2/6)加速期以及44%(4/9)急變期的患者存在PDLIM4 高甲基化。加速期和急變期患者的PDLIM4甲基化水平高于慢性期患者(P=0.052)。PDLIM4 基因RQ-PCR 和RQ-MSP 的典型電泳結(jié)果見圖2。

動態(tài)監(jiān)測1例CML 患者，初發(fā)時PDLIM4 甲基化水平為21.7，經(jīng)治療病情緩解后降至0，其bcr/abl轉(zhuǎn)錄本也呈下降趨勢(6375.84 降至99.52);另外監(jiān)測1例初診后疾病進(jìn)展患者的標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)PDLIM4 甲基化水平由慢性期的3.24 上升到急變期的27.84。

表2 CML 患者PDLIM4 表達(dá)量與臨床特征的關(guān)系Tab 2 Correlations of PDLIM4 expression status with clinical features in CML patients

圖1 CML 患者PDLIM4 基因啟動子的M 和U 亞硫酸氫鹽測序結(jié)果Fig 1 The bisulfite-sequencing results of methylation and unmethylation of PDLIM4 gene promoter in patients with CML.

表3 CML 患者PDLIM4 甲基化水平與臨床參數(shù)的關(guān)系Tab 3 Correlations of the hypermethylation of PDLIM4 promoter with clinical parameters in CML patients

圖2 CML 患者PDLIM4 基因的RQ-PCR 和RQ-MSP 產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig 2 Electropheresis results of RQ-PCR and RQ-MSP products of PDLIM4 gene in CML patients

2.4 CML 患者PDLIM4 甲基化與表達(dá)的相關(guān)性

根據(jù)我們現(xiàn)有的mRNA 和DNA 標(biāo)本，共有13例對照和26例CML 患者同時檢測了PDLIM4 表達(dá)和甲基化水平。26例CML 中，5例高甲基化患者的PDLIM4 表達(dá)水平(中位0.12)低于21例PDLIM4 低甲基化者(中位0. 24)，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.283)。然而CML 患者高甲基化組PDLIM4 的表達(dá)水平顯著低于對照組(中位0.52，P=0.012)。

3 討論

目前普遍認(rèn)為t(9;22)易位所導(dǎo)致的bcr/abl融合基因是CML 發(fā)生的關(guān)鍵因素，而引起CML 疾病進(jìn)展的機(jī)制尚不清楚。近年來的研究表明bcr/abl誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CEBPα 下調(diào)所導(dǎo)致的分化阻滯及由基因組監(jiān)視系統(tǒng)失能，端粒縮短及抑癌基因(如TP53、CDKN2A、DAPK1 等)缺失導(dǎo)致的CML 細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，都可能與CML 疾病發(fā)展有關(guān)［9-11]。

候選抑癌基因PDLIM4 已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中因啟動子高甲基化而低表達(dá)。Boumber 等［3]在PDLIM4 高甲基化失表達(dá)的結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞株RKO及KCT116 上調(diào)PDLIM4 表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長、克隆形成及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;Vanaja 等［5]則發(fā)現(xiàn)PDLIM4 再表達(dá)會抑制前列腺癌細(xì)胞的體內(nèi)外生長。這些研究都表明PDLIM4 具有抑癌基因的功能。

目前國內(nèi)外有關(guān)PDLIM4 基因在CML 患者中的研究甚少。我們首次檢測了CML 中PDLIM4 的表達(dá)，證明22%CML 患者中PDLIM4 表達(dá)水平明顯降低，PDLIM4 與bcr/abl轉(zhuǎn)錄本水平密切相關(guān);且隨著CML 疾病進(jìn)展，PDLIM4 低表達(dá)患者比例明顯增高。同時，我們對PDLIM4 啟動子甲基化態(tài)勢進(jìn)行了分析，揭示22%CML 患者中存在著PDLIM4 啟動子甲基化，且PDLIM4 高甲基化頻率隨疾病進(jìn)展而增高，加速期/急變期與慢性期患者間的差異接近于統(tǒng)計學(xué)意義，這與Jelinek 等 的報道一致。但是，本研究在同時具有PDLIM4 表達(dá)和甲基化水平結(jié)果的26例患者中并未發(fā)現(xiàn)兩者顯著負(fù)相關(guān)，可能原因有二:①本組實驗對象數(shù)量少，尤其是存在高甲基化改變的病例數(shù)過少，影響了統(tǒng)計分析的可靠性;②PDLIM4表達(dá)不僅僅受其啟動子甲基化調(diào)控，可能還受其他機(jī)制調(diào)控，如組蛋白去乙?；?今后對更多CML 患者病例的研究將有利于明確這一問題。

本研究除了發(fā)現(xiàn)PDLIM4 啟動子甲基化頻率隨CML 疾病階段進(jìn)展而增高外，我們還對2例CML 患者不同時期的標(biāo)本進(jìn)行了動態(tài)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)1例初診時PDLIM4 啟動子呈高甲基化狀態(tài)，經(jīng)治療病情緩解后轉(zhuǎn)為低甲基化狀態(tài);另1例由慢性期進(jìn)展到急變期后，甲基化水平提高了近9 倍。我們的初步結(jié)果提示監(jiān)測PDLIM4 甲基化態(tài)勢可能有助于評價治療效果及監(jiān)測疾病發(fā)展，今后將對更多病例進(jìn)行監(jiān)測以明確其臨床意義。Jelinek 等［1]還發(fā)現(xiàn)PDLIM4高甲基化的CML 患者生存時間明顯縮短、與患者對伊馬替尼的治療反應(yīng)無關(guān)，對這類患者可能需要研發(fā)新的治療藥物如Src/Abl 抑制劑。

綜上所述，PDLIM4 基因啟動子高甲基化及低表達(dá)可能與CML 患者疾病進(jìn)展相關(guān)。

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