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    非小細(xì)胞肺癌患者外周血中生存素和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)及臨床意義

    2013-11-22 12:18:08唐興萍李堅(jiān)汪毅
    關(guān)鍵詞:外周血良性陽(yáng)性率

    唐興萍,李堅(jiān),汪毅

    (江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1.呼吸科;2.中心實(shí)驗(yàn)室,江蘇 鎮(zhèn)江212001)

    在全球范圍內(nèi),肺癌的發(fā)病率和病死率居高不下,雖然近年來(lái)診療技術(shù)有很大的進(jìn)步,但是肺癌患者的5年生存率并沒(méi)有明顯升高。臨床上診斷為早期肺癌的患者在獲得腫瘤的根治性切除后,5年生存率約60% ~70%,許多患者仍然死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。這可能與腫瘤早期癌細(xì)胞經(jīng)血液循環(huán)或淋巴結(jié)循環(huán)播散到遠(yuǎn)處臟器有關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)的發(fā)展使得檢測(cè)外周血中微量癌細(xì)胞成為可能,其檢測(cè)敏感性達(dá)70% ~80%。然而,在肺癌微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)中,仍缺少公認(rèn)的特異分子標(biāo)志物[1]。因此,我們迫切需要尋找高敏感和高特異的分子標(biāo)志物,從而建立一種有效的檢測(cè)肺癌患者外周血微轉(zhuǎn)移的方法。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)42例非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者外周血中生存素mRNA和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA的表達(dá),以探討其診斷NSCLC患者血循環(huán)中腫瘤細(xì)胞播散的臨床價(jià)值。

    1 對(duì)象和方法

    1.1 病例

    本研究為前瞻性研究。將2011年11月至2012年8月期間在本院就診,經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為NSCLC的患者42例,作為研究對(duì)象(NSCLC組),其中男26例,女16例,年齡42~88歲,平均年齡68.5歲。根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)2009年修訂的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn),符合Ⅰ+Ⅱ期14例,Ⅲ+Ⅳ期28例;病理類型為鱗癌23例,腺癌19例;低分化癌9例,中高分化癌33例。選擇同期診斷為肺部良性疾病患者20例作為對(duì)照(肺部良性疾病組),其中男14例,女6例,年齡18~75歲,平均年齡57歲,該組患者均同時(shí)排除合并有其他部位惡性腫瘤,其中肺炎9例,慢性支氣管炎4例,結(jié)核性胸膜炎2例,硅肺、氣胸、間質(zhì)性肺病、膿胸、肺結(jié)節(jié)病各1例。所有受試患者均在確診后未進(jìn)行任何治療前抽取外周血作為檢測(cè)標(biāo)本。所有患者皆有完整的臨床資料。

    1.2 方法

    1.2.1 主要試劑和儀器 淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司,Trizol購(gòu)自上海普飛生物公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司,熒光定量試劑盒購(gòu)自日本東洋紡公司,聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增儀和CFX96熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司。

    1.2.2 引物設(shè)計(jì) 引物序列全長(zhǎng)選自PubMed基因庫(kù),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,引物序列及擴(kuò)增片段,見(jiàn)表1。

    表1 引物序列及其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Tab 1 Oligonucleotide sequemces of primers

    1.2.3 標(biāo)本的收集與總RNA的抽提 分別抽取NSCLC患者及肺部良性疾病患者靜脈血4 mL,EDTA抗凝。用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行有核細(xì)胞的分離,用Trizol提取總RNA。

    1.2.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照Fermentas試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的操作程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),cDNA于-70℃保存。1.2.5 熒光定量PCR反應(yīng) 每份外周血標(biāo)本均擴(kuò)增β-肌動(dòng)蛋白、生存素及VEGF。每個(gè)反應(yīng)終體積為20 μL,其中反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL,10 μmol/L 上下游引物各0.5 μL,SYBR10 μL,無(wú)菌水 7 μL。PCR 循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性30 s,然后按95℃ 5 s,57℃ 30 s,72℃30 s,共做40個(gè)循環(huán)。每份標(biāo)本重復(fù)3次進(jìn)行目的基因生存素、VEGF和內(nèi)參照基因β-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增。

    1.2.6 結(jié)果分析 用2-ΔΔCT的方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平,根據(jù)ROC曲線找出折點(diǎn)(上限值),對(duì)于生存素,折點(diǎn)≥1.48為陽(yáng)性,<1.48為陰性。對(duì)于 VEGF,折點(diǎn)≥1.45為陽(yáng)性,<1.45為陰性。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 生存素mRNA和VEGF mRNA在外周血中的相對(duì)表達(dá)量

    生存素mRNA和VEGF mRNA在NSCLC患者和肺部良性疾病患者外周血中的相對(duì)表達(dá)量,見(jiàn)表2。兩組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006;P=0.001)。

    表2 生存素mRNA和VEGF mRNA在兩組患者外周血中的表達(dá)Tab 2 mRNA expression of survivin and vascular endothelial growth factor in two groups

    2.2 生存素mRNA和VEGF mRNA在外周血中的陽(yáng)性表達(dá)

    42例NSCLC患者外周血中生存素mRNA和VEGF mRNA陽(yáng)性表達(dá)率分別為59.5%(25/42)和57.1%(24/42);20例肺部良性疾病患者外周血中生存素mRNA和VEGF mRNA陽(yáng)性表達(dá)率分別為5%(1/20)和0%(0/20);兩組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。

    2.3 NSCLC患者外周血中生存素mRNA和VEGF mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

    42例NSCLC患者外周血中生存素mRNA和VEGF mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤的分期呈顯著相關(guān),Ⅲ期 +Ⅳ期患者外周血中生存素 mRNA和VEGF mRNA的陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ期+Ⅱ期患者(P<0.001;P=0.008);與年齡、性別、吸煙、腫瘤的組織學(xué)類型及分化程度無(wú)明顯相關(guān)性。見(jiàn)表3。

    表3 NSCLC患者外周血中生存素mRNA和VEGF mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab 3 Relationship between clinical characteristics and mRNA expression of survivin and vascular endothelial growth factor in patiens with non-small cell lung cancer

    2.4 生存素mRNA和VEGF mRNA聯(lián)合檢測(cè)的意義

    檢測(cè)外周血生存素mRNA和VEGF mRNA診斷肺癌具有較高的特異性和較好的敏感性,聯(lián)合檢測(cè)2種基因時(shí)可顯著提高診斷的敏感性。見(jiàn)表4。

    表4 外周血生存素mRNA和VEGF mRNA對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值 %(n/n)Tab 4 Diagnostic effect of mRNA expression of survivin and vascular endothelial growth factor in peripheral blood from patients with non-small cell lung cancer

    2.5 NSCLC患者外周血中生存素 mRNA與VEGF mRNA表達(dá)的相關(guān)性

    生存素mRNA與VEGF mRNA在NSCLC患者外周血中共同表達(dá)有16例,生存素mRNA陽(yáng)性組VEGF有9例陰性,生存素mRNA陰性組VEGF有8例陽(yáng)性,根據(jù)一致性檢驗(yàn),結(jié)果表明兩者之間無(wú)相關(guān)性(P >0.05)(表5)。

    表5 NSCLC患者外周血生存素mRNA與VEGF mRNA表達(dá)的相關(guān)性Tab 5 Relationship between mRNA expression of survivin and vascular endothelial growth factor in peripheral blood from patients with non-small cell lung cancer

    3 討論

    生存素是凋亡抑制蛋白家族中的重要成員,具有抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增生,調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂及血管生成等多種生物學(xué)功能。生存素的高表達(dá)可抑制多種因素,如Fas(CD95)、Caspase及抗癌藥物等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。生存素在人類多種腫瘤組織中廣泛表達(dá),也表達(dá)于人類胚胎組織,但是在正常成人終末分化組織中不表達(dá)或呈低表達(dá)[2-3]。Velculescu等[4]報(bào)道,生存素幾乎在所有的人類腫瘤組織中均有不同水平的表達(dá),在100多種腫瘤特異性表達(dá)基因中,其表達(dá)的特異性排前4位。生存素在腫瘤組織高表達(dá)和在成人正常組織中低表達(dá)或不表達(dá),這使其完全有可能成為腫瘤診斷和治療的靶基因[5]。通過(guò)檢測(cè)尿液和胸腔積液標(biāo)本中的生存素mRNA表達(dá)來(lái)診斷膀胱癌和惡性胸腔積液,已被證明具有較高的敏感性和特異性,是一種無(wú)創(chuàng)性診斷膀胱癌和惡性胸腔積液的方法[6-9]。Shen 等[10]采用熒光定量PCR方法測(cè)定結(jié)、直腸癌患者外周血中生存素mRNA,發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性率明顯高于良性結(jié)腸疾病者與健康對(duì)照者,且陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。Cao等[11]研究結(jié)果顯示,食管鱗癌患者外周血中生存素mRNA表達(dá)水平明顯高于良性疾病者及健康對(duì)照者,其陽(yáng)性率與腫瘤血管侵犯、淋巴結(jié)狀態(tài)和臨床分期明顯相關(guān)。Yie等[12]在對(duì)肺癌患者的研究中指出,在接受腫瘤切除術(shù)的NSCLC患者中,外周血中生存素mRNA陽(yáng)性者腫瘤復(fù)發(fā)率明顯高于生存素mRNA陰性者,生存期明顯短于生存素mRNA陰性者。本研究結(jié)果顯示,NSCLC患者外周血中生存素mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為59.5%,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)、直腸癌和乳腺癌患者的檢測(cè)結(jié)果相似[10,13],但高于其他文獻(xiàn)報(bào)道的肺癌和食管鱗癌的測(cè)定結(jié)果[11-12],這可能與本研究中Ⅲ+Ⅳ期NSCLC患者較多有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn),NSCLC患者外周血中生存素mRNA陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分期呈顯著相關(guān),與其他臨床病理學(xué)特征無(wú)相關(guān)性,這可能是由于在不同的研究中患者臨床分期不同所致。

    腫瘤血管生成是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。VEGF是目前所知最重要的血管生長(zhǎng)因子,它直接或間接地作用于血管生成的每一個(gè)環(huán)節(jié),促進(jìn)腫瘤組織中血管生成,腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移。VEGF在50% ~70%的人類肺癌、乳腺癌和直腸癌組織中呈過(guò)表達(dá),而在造血細(xì)胞上通常不表達(dá)[13],故外周血中檢測(cè)到VEGF mRNA說(shuō)明循環(huán)血液中存在腫瘤細(xì)胞。De Luca等[13]測(cè)定了肺癌、乳腺癌和膀胱癌患者外周血VEGF mRNA表達(dá),其陽(yáng)性率分別為57%、48%和73%,且這些患者外周血VEGF mRNA表達(dá)與其原發(fā)腫瘤組織中VEGF蛋白表達(dá)高度一致。Zhong等[14]應(yīng)用 ELISA方法測(cè)定手術(shù)治療前肝癌患者血清中VEGF,結(jié)果顯示,手術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)患者的VEGF陽(yáng)性率明顯高于未復(fù)發(fā)患者,VEGF陽(yáng)性患者的1年、2年和3年生存率顯著低于VEGF陰性患者,表明在影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)有顯性轉(zhuǎn)移而可手術(shù)的患者中,血清VEGF陽(yáng)性是存在血循環(huán)隱匿性微轉(zhuǎn)移的證據(jù)。本研究結(jié)果顯示,VEGF mRNA在NSCLC患者中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于肺部良性疾病組;Ⅲ+Ⅳ期 NSCLC患者VEGF mRNA的陽(yáng)性率顯著高于Ⅰ+Ⅱ期患者。同時(shí),部分Ⅰ+Ⅱ期NSCLC患者外周血生存素mRNA和VEGF mRNA也呈陽(yáng)性表達(dá),提示某些無(wú)顯性轉(zhuǎn)移的早期可手術(shù)患者在手術(shù)之前可能已經(jīng)存在肺癌的血循環(huán)轉(zhuǎn)移。由于本研究中Ⅰ+Ⅱ期患者例數(shù)少,且研究時(shí)間短,因而未能評(píng)估外周血生存素mRNA和VEGF mRNA陽(yáng)性表達(dá)對(duì)接受手術(shù)治療患者預(yù)后的影響。

    多數(shù)研究顯示,與檢測(cè)單一腫瘤特異性標(biāo)志比較,聯(lián)合檢測(cè)外周血中的腫瘤標(biāo)志可顯著提高測(cè)定結(jié)果的敏感性,從而改善診斷效果[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn),聯(lián)合檢測(cè)外周血中生存素mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)可提高陽(yáng)性檢出率。

    綜上所述,熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定外周血中生存素mRNA和VEGF mRNA的表達(dá),對(duì)于檢出血循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞,早期發(fā)現(xiàn)肺癌微轉(zhuǎn)移有一定實(shí)用價(jià)值;其結(jié)果對(duì)于篩選出需手術(shù)前誘導(dǎo)化療的非小細(xì)胞肺癌患者,實(shí)施個(gè)體化治療具有重要的臨床意義。

    [1]Osaki T,Oyama T,Gu CD,et al.Prognostic impact of micrometastatic tumor cells in the lymph nodes and bone marrow of patients with completely resected stageⅠnonsmall-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2002,20(13):2930-2936.

    [2]Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med,1997,3(8):17-21.

    [3]Tamm I,Wang Y,Sausville E,et al.IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas(CD90),Bax,caspase,and anticancer drugs[J].Cancer Res,1998,58(23):5315 -5320.

    [4]Velculescu VE,Madden SL,Zhang L,et al.Analysis of human transcriptomes[J].Nat Genet,1999,23(4):387-388.

    [5]Fukuda S,Pelus LM.Survivin,a cancer target with an emerging role in normal adult tissues[J].Mol Cancer T-her,2006,5(5):1087 -1098.

    [6]Moussa O,Abol-Enein H,Bissada NK,et al.Evaluation of survivin reverse transcriptase-polymerase chain reaction for noninvasive detection of bladder cancer[J].J Urol,2006,175(6):2312-2316.

    [7]Kenney DM,Geschwindt RD,Kary MR,et al.Detection of newly diagnosed bladder cancer,bladder cancer recurrence and bladder cancer in patients with hematuria using quantitative rt-PCR of urinary survivin[J].Tumor Biol,2007,28(2):57-62.

    [8]Wu YK,Chen KT,Kuo YB,et al.Quantitative detection of survivin in malignant pleural effusion for the diagnosis and prognosis of lung cancer[J].Cancer Lett,2009,273(2):331-335.

    [9]Lan CC,Wu YK,Lee CH,et al.Increased survivin mRNA in malignant pleural effusion is significantly correlated with survival[J].Jpn J Clin Oncol,2010,40(3):234 -240.

    [10]Shen C,Hu LH,Xia L,et al.Quantitative real-time RTPCR detection for survivin,CK20 and CEA in peripheral blood of colorectal cancer patients[J].Jpn J Clin Oncol,2008,38(11):770-776.

    [11]Cao M,Yie SM,Wu SM,et al.Detection of survivin-expressing circulating cancer cells in the peripheral blood of patients with esophageal squamous cell carcinoma and its clinical significance[J].Clin Exp Metastasis,2009,26(7):751-758.

    [12]Yie SM,Luo B,Ye NY,et al.Detection of Survivin-expressing circulating cancer cells in the peripheral blood of breast cancer patients by a RT-PCR ELISA[J].Clin Exp Metastasis,2006,23(5/6):279 -289.

    [13]De Luca A,Pignata S,Casamassimi A,et al.Detection of circulating tumor cells in carcinoma patients by a novel epidermal growth factor receptor reverse transcription-PCR assay[J].Clin Cancer Res,2000,6(4):1439 -1444.

    [14]Zhong C,Wei W,Su XK,et al.Serum and tissue vascular endothelial groth factor predicts prognosis in hepatocellular carcinoma patients after partial liver resection[J].Hepatogastroenterology,2012,59(113):93-97.

    [15]Vlems FA,Diepstra JH,Cornelissen IM,et al.Investigations for a multi-marker RT-PCR to improve sensitivity of disseminated tumor cell detection[J].Anticancer Res,2003,23(1A):179-186.

    [16]Chen CC,Chang TW,Chen FM,et al.Combination of multiple mRNA markers(PTTG1,Survivin,UbcH10 and TK1)in the diagnosis of Taiwanese patients with breast cancer by membrane array[J].Oncology,2006,70(4):438-446.

    [17]Pu XY,Wang ZP,Chen YR,et al.The value of combined use of survivin,cytokeratin 20 and mucin 7 mRNA for bladder cancer detection in voided urine[J].J Cancer Res Clin Oncol,2008,134(6):659 -665.

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