• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    非小細(xì)胞肺癌患者外周血中生存素和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)及臨床意義

    2013-11-22 12:18:08唐興萍李堅(jiān)汪毅
    關(guān)鍵詞:外周血良性陽(yáng)性率

    唐興萍,李堅(jiān),汪毅

    (江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1.呼吸科;2.中心實(shí)驗(yàn)室,江蘇 鎮(zhèn)江212001)

    在全球范圍內(nèi),肺癌的發(fā)病率和病死率居高不下,雖然近年來(lái)診療技術(shù)有很大的進(jìn)步,但是肺癌患者的5年生存率并沒(méi)有明顯升高。臨床上診斷為早期肺癌的患者在獲得腫瘤的根治性切除后,5年生存率約60% ~70%,許多患者仍然死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。這可能與腫瘤早期癌細(xì)胞經(jīng)血液循環(huán)或淋巴結(jié)循環(huán)播散到遠(yuǎn)處臟器有關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)的發(fā)展使得檢測(cè)外周血中微量癌細(xì)胞成為可能,其檢測(cè)敏感性達(dá)70% ~80%。然而,在肺癌微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)中,仍缺少公認(rèn)的特異分子標(biāo)志物[1]。因此,我們迫切需要尋找高敏感和高特異的分子標(biāo)志物,從而建立一種有效的檢測(cè)肺癌患者外周血微轉(zhuǎn)移的方法。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)42例非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者外周血中生存素mRNA和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA的表達(dá),以探討其診斷NSCLC患者血循環(huán)中腫瘤細(xì)胞播散的臨床價(jià)值。

    1 對(duì)象和方法

    1.1 病例

    本研究為前瞻性研究。將2011年11月至2012年8月期間在本院就診,經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為NSCLC的患者42例,作為研究對(duì)象(NSCLC組),其中男26例,女16例,年齡42~88歲,平均年齡68.5歲。根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)2009年修訂的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn),符合Ⅰ+Ⅱ期14例,Ⅲ+Ⅳ期28例;病理類型為鱗癌23例,腺癌19例;低分化癌9例,中高分化癌33例。選擇同期診斷為肺部良性疾病患者20例作為對(duì)照(肺部良性疾病組),其中男14例,女6例,年齡18~75歲,平均年齡57歲,該組患者均同時(shí)排除合并有其他部位惡性腫瘤,其中肺炎9例,慢性支氣管炎4例,結(jié)核性胸膜炎2例,硅肺、氣胸、間質(zhì)性肺病、膿胸、肺結(jié)節(jié)病各1例。所有受試患者均在確診后未進(jìn)行任何治療前抽取外周血作為檢測(cè)標(biāo)本。所有患者皆有完整的臨床資料。

    1.2 方法

    1.2.1 主要試劑和儀器 淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司,Trizol購(gòu)自上海普飛生物公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司,熒光定量試劑盒購(gòu)自日本東洋紡公司,聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增儀和CFX96熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司。

    1.2.2 引物設(shè)計(jì) 引物序列全長(zhǎng)選自PubMed基因庫(kù),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,引物序列及擴(kuò)增片段,見(jiàn)表1。

    表1 引物序列及其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Tab 1 Oligonucleotide sequemces of primers

    1.2.3 標(biāo)本的收集與總RNA的抽提 分別抽取NSCLC患者及肺部良性疾病患者靜脈血4 mL,EDTA抗凝。用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行有核細(xì)胞的分離,用Trizol提取總RNA。

    1.2.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照Fermentas試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的操作程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),cDNA于-70℃保存。1.2.5 熒光定量PCR反應(yīng) 每份外周血標(biāo)本均擴(kuò)增β-肌動(dòng)蛋白、生存素及VEGF。每個(gè)反應(yīng)終體積為20 μL,其中反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL,10 μmol/L 上下游引物各0.5 μL,SYBR10 μL,無(wú)菌水 7 μL。PCR 循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性30 s,然后按95℃ 5 s,57℃ 30 s,72℃30 s,共做40個(gè)循環(huán)。每份標(biāo)本重復(fù)3次進(jìn)行目的基因生存素、VEGF和內(nèi)參照基因β-肌動(dòng)蛋白擴(kuò)增。

    1.2.6 結(jié)果分析 用2-ΔΔCT的方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平,根據(jù)ROC曲線找出折點(diǎn)(上限值),對(duì)于生存素,折點(diǎn)≥1.48為陽(yáng)性,<1.48為陰性。對(duì)于 VEGF,折點(diǎn)≥1.45為陽(yáng)性,<1.45為陰性。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 生存素mRNA和VEGF mRNA在外周血中的相對(duì)表達(dá)量

    生存素mRNA和VEGF mRNA在NSCLC患者和肺部良性疾病患者外周血中的相對(duì)表達(dá)量,見(jiàn)表2。兩組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006;P=0.001)。

    表2 生存素mRNA和VEGF mRNA在兩組患者外周血中的表達(dá)Tab 2 mRNA expression of survivin and vascular endothelial growth factor in two groups

    2.2 生存素mRNA和VEGF mRNA在外周血中的陽(yáng)性表達(dá)

    42例NSCLC患者外周血中生存素mRNA和VEGF mRNA陽(yáng)性表達(dá)率分別為59.5%(25/42)和57.1%(24/42);20例肺部良性疾病患者外周血中生存素mRNA和VEGF mRNA陽(yáng)性表達(dá)率分別為5%(1/20)和0%(0/20);兩組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。

    2.3 NSCLC患者外周血中生存素mRNA和VEGF mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

    42例NSCLC患者外周血中生存素mRNA和VEGF mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤的分期呈顯著相關(guān),Ⅲ期 +Ⅳ期患者外周血中生存素 mRNA和VEGF mRNA的陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ期+Ⅱ期患者(P<0.001;P=0.008);與年齡、性別、吸煙、腫瘤的組織學(xué)類型及分化程度無(wú)明顯相關(guān)性。見(jiàn)表3。

    表3 NSCLC患者外周血中生存素mRNA和VEGF mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab 3 Relationship between clinical characteristics and mRNA expression of survivin and vascular endothelial growth factor in patiens with non-small cell lung cancer

    2.4 生存素mRNA和VEGF mRNA聯(lián)合檢測(cè)的意義

    檢測(cè)外周血生存素mRNA和VEGF mRNA診斷肺癌具有較高的特異性和較好的敏感性,聯(lián)合檢測(cè)2種基因時(shí)可顯著提高診斷的敏感性。見(jiàn)表4。

    表4 外周血生存素mRNA和VEGF mRNA對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值 %(n/n)Tab 4 Diagnostic effect of mRNA expression of survivin and vascular endothelial growth factor in peripheral blood from patients with non-small cell lung cancer

    2.5 NSCLC患者外周血中生存素 mRNA與VEGF mRNA表達(dá)的相關(guān)性

    生存素mRNA與VEGF mRNA在NSCLC患者外周血中共同表達(dá)有16例,生存素mRNA陽(yáng)性組VEGF有9例陰性,生存素mRNA陰性組VEGF有8例陽(yáng)性,根據(jù)一致性檢驗(yàn),結(jié)果表明兩者之間無(wú)相關(guān)性(P >0.05)(表5)。

    表5 NSCLC患者外周血生存素mRNA與VEGF mRNA表達(dá)的相關(guān)性Tab 5 Relationship between mRNA expression of survivin and vascular endothelial growth factor in peripheral blood from patients with non-small cell lung cancer

    3 討論

    生存素是凋亡抑制蛋白家族中的重要成員,具有抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增生,調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂及血管生成等多種生物學(xué)功能。生存素的高表達(dá)可抑制多種因素,如Fas(CD95)、Caspase及抗癌藥物等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。生存素在人類多種腫瘤組織中廣泛表達(dá),也表達(dá)于人類胚胎組織,但是在正常成人終末分化組織中不表達(dá)或呈低表達(dá)[2-3]。Velculescu等[4]報(bào)道,生存素幾乎在所有的人類腫瘤組織中均有不同水平的表達(dá),在100多種腫瘤特異性表達(dá)基因中,其表達(dá)的特異性排前4位。生存素在腫瘤組織高表達(dá)和在成人正常組織中低表達(dá)或不表達(dá),這使其完全有可能成為腫瘤診斷和治療的靶基因[5]。通過(guò)檢測(cè)尿液和胸腔積液標(biāo)本中的生存素mRNA表達(dá)來(lái)診斷膀胱癌和惡性胸腔積液,已被證明具有較高的敏感性和特異性,是一種無(wú)創(chuàng)性診斷膀胱癌和惡性胸腔積液的方法[6-9]。Shen 等[10]采用熒光定量PCR方法測(cè)定結(jié)、直腸癌患者外周血中生存素mRNA,發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性率明顯高于良性結(jié)腸疾病者與健康對(duì)照者,且陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。Cao等[11]研究結(jié)果顯示,食管鱗癌患者外周血中生存素mRNA表達(dá)水平明顯高于良性疾病者及健康對(duì)照者,其陽(yáng)性率與腫瘤血管侵犯、淋巴結(jié)狀態(tài)和臨床分期明顯相關(guān)。Yie等[12]在對(duì)肺癌患者的研究中指出,在接受腫瘤切除術(shù)的NSCLC患者中,外周血中生存素mRNA陽(yáng)性者腫瘤復(fù)發(fā)率明顯高于生存素mRNA陰性者,生存期明顯短于生存素mRNA陰性者。本研究結(jié)果顯示,NSCLC患者外周血中生存素mRNA陽(yáng)性表達(dá)率為59.5%,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)、直腸癌和乳腺癌患者的檢測(cè)結(jié)果相似[10,13],但高于其他文獻(xiàn)報(bào)道的肺癌和食管鱗癌的測(cè)定結(jié)果[11-12],這可能與本研究中Ⅲ+Ⅳ期NSCLC患者較多有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn),NSCLC患者外周血中生存素mRNA陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分期呈顯著相關(guān),與其他臨床病理學(xué)特征無(wú)相關(guān)性,這可能是由于在不同的研究中患者臨床分期不同所致。

    腫瘤血管生成是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。VEGF是目前所知最重要的血管生長(zhǎng)因子,它直接或間接地作用于血管生成的每一個(gè)環(huán)節(jié),促進(jìn)腫瘤組織中血管生成,腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移。VEGF在50% ~70%的人類肺癌、乳腺癌和直腸癌組織中呈過(guò)表達(dá),而在造血細(xì)胞上通常不表達(dá)[13],故外周血中檢測(cè)到VEGF mRNA說(shuō)明循環(huán)血液中存在腫瘤細(xì)胞。De Luca等[13]測(cè)定了肺癌、乳腺癌和膀胱癌患者外周血VEGF mRNA表達(dá),其陽(yáng)性率分別為57%、48%和73%,且這些患者外周血VEGF mRNA表達(dá)與其原發(fā)腫瘤組織中VEGF蛋白表達(dá)高度一致。Zhong等[14]應(yīng)用 ELISA方法測(cè)定手術(shù)治療前肝癌患者血清中VEGF,結(jié)果顯示,手術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)患者的VEGF陽(yáng)性率明顯高于未復(fù)發(fā)患者,VEGF陽(yáng)性患者的1年、2年和3年生存率顯著低于VEGF陰性患者,表明在影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)有顯性轉(zhuǎn)移而可手術(shù)的患者中,血清VEGF陽(yáng)性是存在血循環(huán)隱匿性微轉(zhuǎn)移的證據(jù)。本研究結(jié)果顯示,VEGF mRNA在NSCLC患者中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于肺部良性疾病組;Ⅲ+Ⅳ期 NSCLC患者VEGF mRNA的陽(yáng)性率顯著高于Ⅰ+Ⅱ期患者。同時(shí),部分Ⅰ+Ⅱ期NSCLC患者外周血生存素mRNA和VEGF mRNA也呈陽(yáng)性表達(dá),提示某些無(wú)顯性轉(zhuǎn)移的早期可手術(shù)患者在手術(shù)之前可能已經(jīng)存在肺癌的血循環(huán)轉(zhuǎn)移。由于本研究中Ⅰ+Ⅱ期患者例數(shù)少,且研究時(shí)間短,因而未能評(píng)估外周血生存素mRNA和VEGF mRNA陽(yáng)性表達(dá)對(duì)接受手術(shù)治療患者預(yù)后的影響。

    多數(shù)研究顯示,與檢測(cè)單一腫瘤特異性標(biāo)志比較,聯(lián)合檢測(cè)外周血中的腫瘤標(biāo)志可顯著提高測(cè)定結(jié)果的敏感性,從而改善診斷效果[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn),聯(lián)合檢測(cè)外周血中生存素mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)可提高陽(yáng)性檢出率。

    綜上所述,熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定外周血中生存素mRNA和VEGF mRNA的表達(dá),對(duì)于檢出血循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞,早期發(fā)現(xiàn)肺癌微轉(zhuǎn)移有一定實(shí)用價(jià)值;其結(jié)果對(duì)于篩選出需手術(shù)前誘導(dǎo)化療的非小細(xì)胞肺癌患者,實(shí)施個(gè)體化治療具有重要的臨床意義。

    [1]Osaki T,Oyama T,Gu CD,et al.Prognostic impact of micrometastatic tumor cells in the lymph nodes and bone marrow of patients with completely resected stageⅠnonsmall-cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2002,20(13):2930-2936.

    [2]Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med,1997,3(8):17-21.

    [3]Tamm I,Wang Y,Sausville E,et al.IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas(CD90),Bax,caspase,and anticancer drugs[J].Cancer Res,1998,58(23):5315 -5320.

    [4]Velculescu VE,Madden SL,Zhang L,et al.Analysis of human transcriptomes[J].Nat Genet,1999,23(4):387-388.

    [5]Fukuda S,Pelus LM.Survivin,a cancer target with an emerging role in normal adult tissues[J].Mol Cancer T-her,2006,5(5):1087 -1098.

    [6]Moussa O,Abol-Enein H,Bissada NK,et al.Evaluation of survivin reverse transcriptase-polymerase chain reaction for noninvasive detection of bladder cancer[J].J Urol,2006,175(6):2312-2316.

    [7]Kenney DM,Geschwindt RD,Kary MR,et al.Detection of newly diagnosed bladder cancer,bladder cancer recurrence and bladder cancer in patients with hematuria using quantitative rt-PCR of urinary survivin[J].Tumor Biol,2007,28(2):57-62.

    [8]Wu YK,Chen KT,Kuo YB,et al.Quantitative detection of survivin in malignant pleural effusion for the diagnosis and prognosis of lung cancer[J].Cancer Lett,2009,273(2):331-335.

    [9]Lan CC,Wu YK,Lee CH,et al.Increased survivin mRNA in malignant pleural effusion is significantly correlated with survival[J].Jpn J Clin Oncol,2010,40(3):234 -240.

    [10]Shen C,Hu LH,Xia L,et al.Quantitative real-time RTPCR detection for survivin,CK20 and CEA in peripheral blood of colorectal cancer patients[J].Jpn J Clin Oncol,2008,38(11):770-776.

    [11]Cao M,Yie SM,Wu SM,et al.Detection of survivin-expressing circulating cancer cells in the peripheral blood of patients with esophageal squamous cell carcinoma and its clinical significance[J].Clin Exp Metastasis,2009,26(7):751-758.

    [12]Yie SM,Luo B,Ye NY,et al.Detection of Survivin-expressing circulating cancer cells in the peripheral blood of breast cancer patients by a RT-PCR ELISA[J].Clin Exp Metastasis,2006,23(5/6):279 -289.

    [13]De Luca A,Pignata S,Casamassimi A,et al.Detection of circulating tumor cells in carcinoma patients by a novel epidermal growth factor receptor reverse transcription-PCR assay[J].Clin Cancer Res,2000,6(4):1439 -1444.

    [14]Zhong C,Wei W,Su XK,et al.Serum and tissue vascular endothelial groth factor predicts prognosis in hepatocellular carcinoma patients after partial liver resection[J].Hepatogastroenterology,2012,59(113):93-97.

    [15]Vlems FA,Diepstra JH,Cornelissen IM,et al.Investigations for a multi-marker RT-PCR to improve sensitivity of disseminated tumor cell detection[J].Anticancer Res,2003,23(1A):179-186.

    [16]Chen CC,Chang TW,Chen FM,et al.Combination of multiple mRNA markers(PTTG1,Survivin,UbcH10 and TK1)in the diagnosis of Taiwanese patients with breast cancer by membrane array[J].Oncology,2006,70(4):438-446.

    [17]Pu XY,Wang ZP,Chen YR,et al.The value of combined use of survivin,cytokeratin 20 and mucin 7 mRNA for bladder cancer detection in voided urine[J].J Cancer Res Clin Oncol,2008,134(6):659 -665.

    猜你喜歡
    外周血良性陽(yáng)性率
    走出睡眠認(rèn)知誤區(qū),建立良性睡眠條件反射
    中老年保健(2022年6期)2022-08-19 01:41:22
    呼倫貝爾沙地實(shí)現(xiàn)良性逆轉(zhuǎn)
    不同類型標(biāo)本不同時(shí)間微生物檢驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性率分析
    基層良性發(fā)展從何入手
    甲狀腺良性病變行甲狀腺全切除術(shù)治療的效果分析
    急性藥物性肝損傷患者肝病相關(guān)抗體陽(yáng)性率調(diào)查及其臨床意義
    白血病外周血體外診斷技術(shù)及產(chǎn)品
    密切接觸者PPD強(qiáng)陽(yáng)性率在學(xué)校結(jié)核病暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值
    肌電圖在肘管綜合征中的診斷陽(yáng)性率與鑒別診斷
    結(jié)腸炎小鼠外周血和結(jié)腸上皮組織中Gal-9的表達(dá)
    看黄色毛片网站| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久这里只有精品中国| 中文字幕熟女人妻在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产视频内射| 国产私拍福利视频在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 国产探花在线观看一区二区| 日韩有码中文字幕| 哪里可以看免费的av片| 成人午夜高清在线视频| 国产亚洲欧美98| 怎么达到女性高潮| 国产精品久久久久久久电影 | 精品国产亚洲在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 岛国在线免费视频观看| 久久久国产成人精品二区| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 午夜免费观看网址| 麻豆av在线久日| 久久草成人影院| 中文字幕av在线有码专区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产69精品久久久久777片 | 欧美黑人巨大hd| 首页视频小说图片口味搜索| 国产免费男女视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 男女床上黄色一级片免费看| 精品欧美国产一区二区三| 久久久久精品国产欧美久久久| 757午夜福利合集在线观看| av中文乱码字幕在线| 床上黄色一级片| 国产成人影院久久av| 日本三级黄在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 搡老岳熟女国产| 国产精品精品国产色婷婷| 麻豆国产av国片精品| 久久国产精品人妻蜜桃| 女同久久另类99精品国产91| 黄片小视频在线播放| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 99热精品在线国产| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久精品影院6| 国产亚洲精品久久久com| 欧美大码av| 久久国产精品影院| 国产精品,欧美在线| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 99久国产av精品| 亚洲自偷自拍图片 自拍| av天堂在线播放| 欧美一区二区国产精品久久精品| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲专区字幕在线| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产成人精品无人区| 国产成人欧美在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产精品久久视频播放| 亚洲第一电影网av| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品九九99| 99在线视频只有这里精品首页| 国产亚洲欧美98| 观看免费一级毛片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 久久99热这里只有精品18| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 色综合欧美亚洲国产小说| 一本久久中文字幕| 亚洲欧美日韩高清专用| 精品无人区乱码1区二区| 91麻豆av在线| 国产高清三级在线| 在线观看舔阴道视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 午夜福利在线在线| 免费看a级黄色片| 色吧在线观看| 免费观看人在逋| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 成年女人毛片免费观看观看9| 日韩国内少妇激情av| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 在线观看午夜福利视频| 成人一区二区视频在线观看| 最好的美女福利视频网| 亚洲熟妇熟女久久| aaaaa片日本免费| 国产伦精品一区二区三区四那| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲人成电影免费在线| 香蕉av资源在线| 日韩成人在线观看一区二区三区| 免费电影在线观看免费观看| 听说在线观看完整版免费高清| av视频在线观看入口| 欧美色视频一区免费| www国产在线视频色| 91麻豆av在线| 久久伊人香网站| 91在线观看av| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产99白浆流出| 午夜a级毛片| 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美3d第一页| 黄色成人免费大全| 18禁国产床啪视频网站| 操出白浆在线播放| 一个人看视频在线观看www免费 | 久久久久久国产a免费观看| 国内精品久久久久久久电影| h日本视频在线播放| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 日本一二三区视频观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品av久久久久免费| 99久国产av精品| 黄色成人免费大全| 国产黄a三级三级三级人| 麻豆成人午夜福利视频| 国产午夜精品论理片| av国产免费在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 搡老岳熟女国产| 久久久久国内视频| 可以在线观看毛片的网站| 欧美又色又爽又黄视频| 嫩草影院入口| 国产精品野战在线观看| 欧美在线黄色| 在线观看免费午夜福利视频| 国产毛片a区久久久久| 色吧在线观看| av片东京热男人的天堂| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲精品色激情综合| 亚洲人成伊人成综合网2020| av福利片在线观看| 黄色女人牲交| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲成人中文字幕在线播放| 色综合站精品国产| av女优亚洲男人天堂 | 日本黄色视频三级网站网址| 草草在线视频免费看| 国产伦人伦偷精品视频| 国产视频内射| 99久久99久久久精品蜜桃| 大型黄色视频在线免费观看| 天堂√8在线中文| 久久久久国内视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲欧美日韩东京热| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产黄a三级三级三级人| 好男人在线观看高清免费视频| 一本精品99久久精品77| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品综合久久久久久久免费| 宅男免费午夜| 天天躁日日操中文字幕| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久香蕉精品热| 国产精品一及| 免费人成视频x8x8入口观看| 99久久综合精品五月天人人| 不卡av一区二区三区| 亚洲国产精品999在线| 露出奶头的视频| tocl精华| 亚洲av成人精品一区久久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 一区二区三区激情视频| 亚洲片人在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| av片东京热男人的天堂| 国产成人精品久久二区二区免费| 999久久久国产精品视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产淫片久久久久久久久 | 精品国产三级普通话版| 91在线精品国自产拍蜜月 | 亚洲av成人精品一区久久| 1000部很黄的大片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 毛片女人毛片| 操出白浆在线播放| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲国产精品合色在线| 午夜免费成人在线视频| 在线免费观看的www视频| 国产精品 国内视频| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久中文字幕一级| 色视频www国产| 国产午夜精品论理片| 午夜影院日韩av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲成人久久性| 哪里可以看免费的av片| 夜夜夜夜夜久久久久| 成人永久免费在线观看视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 十八禁网站免费在线| 欧美黑人巨大hd| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产激情偷乱视频一区二区| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 熟女人妻精品中文字幕| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日韩免费av在线播放| 90打野战视频偷拍视频| 两人在一起打扑克的视频| 成人永久免费在线观看视频| 美女大奶头视频| 91久久精品国产一区二区成人 | 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 九色国产91popny在线| 国产精品久久久av美女十八| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产极品精品免费视频能看的| 性色av乱码一区二区三区2| 日韩大尺度精品在线看网址| 丰满的人妻完整版| 91麻豆av在线| 久久国产乱子伦精品免费另类| 99在线视频只有这里精品首页| 精品福利观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 成人精品一区二区免费| 88av欧美| 99久久成人亚洲精品观看| 午夜福利18| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久中文字幕人妻熟女| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美午夜高清在线| 99久久综合精品五月天人人| 免费在线观看影片大全网站| 国产成人影院久久av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲国产欧美人成| 91老司机精品| 美女黄网站色视频| 级片在线观看| 久久亚洲精品不卡| 老司机午夜福利在线观看视频| 两个人的视频大全免费| 午夜免费激情av| 婷婷亚洲欧美| 18禁美女被吸乳视频| 国产精品野战在线观看| 国产av不卡久久| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲国产精品999在线| 三级毛片av免费| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品电影一区二区三区| 午夜a级毛片| 欧美3d第一页| 亚洲自拍偷在线| 在线观看免费午夜福利视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久久九九精品影院| 国产精品1区2区在线观看.| 性色av乱码一区二区三区2| 久久久久久久久中文| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产真人三级小视频在线观看| 国产成人av教育| 一区二区三区激情视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 69av精品久久久久久| 久久精品国产综合久久久| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 观看免费一级毛片| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久久久久久免费视频了| 精品乱码久久久久久99久播| 国产人伦9x9x在线观看| 99久久精品热视频| 高清在线国产一区| 亚洲片人在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产日本99.免费观看| 两个人的视频大全免费| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一区二区三区激情视频| 毛片女人毛片| av在线蜜桃| 一本久久中文字幕| 一级黄色大片毛片| 性色avwww在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 夜夜爽天天搞| 成年版毛片免费区| 亚洲精华国产精华精| 国产精品国产高清国产av| 亚洲九九香蕉| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产一区二区激情短视频| 99热这里只有是精品50| 十八禁网站免费在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 五月伊人婷婷丁香| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品影院久久| aaaaa片日本免费| 久久精品人妻少妇| 三级毛片av免费| 日本免费一区二区三区高清不卡| 可以在线观看的亚洲视频| 一本综合久久免费| 国产精品久久久久久精品电影| 美女 人体艺术 gogo| 午夜成年电影在线免费观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 最新在线观看一区二区三区| 色老头精品视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲av五月六月丁香网| 国产午夜福利久久久久久| 精品国产乱码久久久久久男人| av黄色大香蕉| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产精品乱码一区二三区的特点| 波多野结衣高清作品| 国产精品亚洲av一区麻豆| 999久久久精品免费观看国产| 日本a在线网址| 国产精品一区二区免费欧美| 午夜福利18| 1024手机看黄色片| 手机成人av网站| 国产一区二区激情短视频| 国产成人啪精品午夜网站| 男人舔奶头视频| 午夜免费激情av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久久久久久久久黄片| 欧美黄色淫秽网站| 欧美三级亚洲精品| 18禁美女被吸乳视频| 国产人伦9x9x在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产精华一区二区三区| 国内精品久久久久精免费| 国产一区在线观看成人免费| 久9热在线精品视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产真实乱freesex| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 又爽又黄无遮挡网站| 在线观看免费视频日本深夜| 嫩草影院精品99| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品久久久av美女十八| 国产淫片久久久久久久久 | 亚洲精品中文字幕一二三四区| 一级毛片精品| 宅男免费午夜| 国产精品久久电影中文字幕| 12—13女人毛片做爰片一| 国产黄色小视频在线观看| 一级毛片精品| 日韩欧美精品v在线| 18禁国产床啪视频网站| 桃红色精品国产亚洲av| 国产亚洲精品一区二区www| 久久久久久久久久黄片| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 色老头精品视频在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 成人亚洲精品av一区二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲国产精品成人综合色| 韩国av一区二区三区四区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲国产中文字幕在线视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 一本一本综合久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久久精品欧美日韩精品| 男女那种视频在线观看| 亚洲片人在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 日韩人妻高清精品专区| 俺也久久电影网| 手机成人av网站| 性色av乱码一区二区三区2| 日韩欧美在线乱码| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 男女那种视频在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 国产99白浆流出| 久久久国产成人免费| 神马国产精品三级电影在线观看| 婷婷丁香在线五月| 国产精品,欧美在线| 日日夜夜操网爽| 成在线人永久免费视频| 老司机在亚洲福利影院| tocl精华| 午夜影院日韩av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 午夜免费观看网址| 国产在线精品亚洲第一网站| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品国产高清国产av| 日韩高清综合在线| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品久久久久久精品电影| 国内精品久久久久精免费| 90打野战视频偷拍视频| 手机成人av网站| 免费观看的影片在线观看| 国产乱人视频| 免费看日本二区| 国产高清激情床上av| 久久人妻av系列| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲无线观看免费| 久久亚洲真实| 国内精品美女久久久久久| 免费在线观看成人毛片| 午夜a级毛片| 91老司机精品| 99国产综合亚洲精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精品人妻1区二区| 首页视频小说图片口味搜索| 91麻豆精品激情在线观看国产| 一级毛片精品| 岛国在线免费视频观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产真人三级小视频在线观看| 国产av一区在线观看免费| 欧美午夜高清在线| 丁香六月欧美| 久久中文字幕人妻熟女| 在线a可以看的网站| 最近在线观看免费完整版| 国产精品影院久久| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产高清有码在线观看视频| 日韩精品中文字幕看吧| 性色avwww在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 欧美中文综合在线视频| 一二三四社区在线视频社区8| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 中亚洲国语对白在线视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产97色在线日韩免费| 美女黄网站色视频| 黑人操中国人逼视频| 亚洲黑人精品在线| 老熟妇仑乱视频hdxx| 91麻豆av在线| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产伦一二天堂av在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久久成人免费电影| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 一级毛片高清免费大全| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产高清videossex| 亚洲国产看品久久| 少妇的丰满在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 色综合欧美亚洲国产小说| 少妇丰满av| svipshipincom国产片| 99久久精品热视频| 国产成人欧美在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国内精品久久久久久久电影| av天堂在线播放| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲欧美日韩无卡精品| 免费看日本二区| 一a级毛片在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久99热这里只有精品18| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品乱码久久久久久99久播| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产一区二区激情短视频| netflix在线观看网站| 91av网站免费观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| www日本在线高清视频| 久久久国产成人免费| www日本黄色视频网| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美日韩黄片免| 欧美一级毛片孕妇| 麻豆国产97在线/欧美| 老司机在亚洲福利影院| 午夜激情欧美在线| 亚洲激情在线av| 亚洲av成人一区二区三| 午夜免费激情av| 日韩成人在线观看一区二区三区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产伦人伦偷精品视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产精品久久电影中文字幕| a级毛片a级免费在线| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 激情在线观看视频在线高清| 精品欧美国产一区二区三| 99re在线观看精品视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久精品91无色码中文字幕| 男女午夜视频在线观看| 天堂网av新在线| 91av网站免费观看| 精品福利观看| 欧美黑人巨大hd| 亚洲午夜理论影院| 国产乱人视频| 久99久视频精品免费| 精品国产超薄肉色丝袜足j| а√天堂www在线а√下载| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 中文字幕高清在线视频| 久久中文字幕一级| 成年版毛片免费区| 这个男人来自地球电影免费观看| 身体一侧抽搐| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 中文字幕最新亚洲高清| 99精品欧美一区二区三区四区| 成人精品一区二区免费| 男女之事视频高清在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 久久性视频一级片| 嫩草影视91久久| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 制服丝袜大香蕉在线| 国产精品亚洲一级av第二区| 1024手机看黄色片| 精品人妻1区二区| 国产成人av激情在线播放| 色播亚洲综合网| 国产男靠女视频免费网站| 国内精品久久久久精免费| 日本 欧美在线| 午夜影院日韩av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 一个人免费在线观看电影 | 色av中文字幕| 国产三级黄色录像| 亚洲成人免费电影在线观看| www国产在线视频色| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲成人免费电影在线观看| 老司机福利观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 色哟哟哟哟哟哟| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产伦人伦偷精品视频| 大型黄色视频在线免费观看| 国产高清三级在线| 性色av乱码一区二区三区2|