建立高分辨熔解曲線(xiàn)分析法檢測(cè)SF3B1基因突變

楊靜，姚冬明，錢(qián)軍，王翠竹，楊小飛，林江，李云，陳星星，肖高飛，馬吉春

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院1.血液科，2.中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江212002)

RNA剪接是真核細(xì)胞基因表達(dá)中一個(gè)非常重要的生物過(guò)程，它通過(guò)選擇性剪切在維持蛋白質(zhì)的多樣性方面起著重要的作用［1－2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中存在的RNA剪接的異常改變可引起多個(gè)基因突變的發(fā)生［2－3］。SF3B1蛋白是剪切因子3b蛋白復(fù)合物的一個(gè)亞單位，在RNA剪接過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［4］。最新研究發(fā)現(xiàn)，6.5% ～28.1%的骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)和5% ～15%的慢性淋巴細(xì)胞白血病患者中存在著SF3B1基因突變，其突變位點(diǎn)主要發(fā)生于密碼子E622、H662、K666 和 K700［5－11］。高分辨熔解曲線(xiàn)分析(high-resolution melting analysis，HRMA)是一種靈敏度高、特異性好、可靠及快速的突變檢測(cè)方法［12］。我們擬建立HRMA技術(shù)檢測(cè)MDS患者的SF3B1基因突變。

1 對(duì)象和方法

1.1 病例

我院血液科初診MDS患者30例，其中男18例，女12例;年齡 30～78歲，平均年齡58歲。MDS診斷按 WHO標(biāo)準(zhǔn)［13］，其中難治性貧血(refractory anemia，RA)9例、伴環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞的難治性貧血(RA with ringed sideroblasts，RARS)1例、伴多系病態(tài)造血的難治性血細(xì)胞減少癥(refractory cytopenia with multilineage dysplasia，RCMD)18例、伴環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞的RCMD(RCMDRS)2例。本研究獲得了江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器

Ficoll-Hypaque，上海試劑二廠(chǎng);基因組DNA提取試劑盒，Gentra公司;PCR試劑，X-gal和 IPTG，TaKaRa公司;Taq DNA酶，MBI Fermentas公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，AxyPrep質(zhì)粒提取試劑盒，PCR耗材，Axygen公司;T4 DNA連接酶，Promega公司;1×LCGreen Plus，Idaho公司;PCR引物和溫度內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)品片段序列由上?；瞪锕こ碳夹g(shù)服務(wù)有限公司合成;ABI7300 PCR儀，美國(guó)ABI公司;凝膠成像儀，英國(guó) Syngene公司;LightScanner分析儀，美國(guó)Idaho公司。

1.3 骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離和基因組DNA提取

用人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Hypaque)分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

應(yīng)用LightScanner引物設(shè)計(jì)軟件 V 1.0(Idaho Technology，Salt Lake City，Utah)設(shè)計(jì)針對(duì)4個(gè)突變位點(diǎn)的引物，引物序列見(jiàn)表1。25 μL PCR反應(yīng)體系包括 1×PCR 緩沖 液、0.25mmol/L dNTP、2.5 mmol/L MgCl2、引物 0.8 μmol/L、高溫和低溫內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)品 0.8 μmol/L［14］、1 × LCGreen Plus、1 U Taq DNA酶及樣本DNA 50 ng。將25 μL體系置于PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。

1.5 HRMA 檢測(cè)

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于LightScanner分析儀中，從55℃到95℃以0.1℃/s逐步加熱，應(yīng)用CALLIT 2.0軟件(美國(guó)Idaho Technology公司)對(duì)采集后的熒光曲線(xiàn)進(jìn)行分析，應(yīng)用低溫內(nèi)標(biāo)和高溫內(nèi)標(biāo)的Tm值對(duì)標(biāo)本進(jìn)行校準(zhǔn)、標(biāo)化處理。

1.6 PCR 產(chǎn)物測(cè)序

應(yīng)用ABI 3730 DNA測(cè)序儀來(lái)驗(yàn)證HRMA檢測(cè)的結(jié)果，測(cè)序引物序列見(jiàn)表1。

表1 高分辨熔解曲線(xiàn)分析及DNA測(cè)序的PCR引物序列Tab 1 Primers for high-resolution melting analysis and DNA sequencing

2 結(jié)果

2.1 HRMA 檢測(cè)結(jié)果

溫度內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)品能使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)較校準(zhǔn)前更為均一(圖1a和1b)。通過(guò)HRMA結(jié)果中熔解曲線(xiàn)和熔解峰的形狀能對(duì)SF3B1基因突變進(jìn)行鑒別。30例MDS標(biāo)本中2例呈現(xiàn)復(fù)雜坡度的標(biāo)化熔解峰(圖1c和1d)，為突變型SF3B1基因標(biāo)本;而其余標(biāo)本均呈現(xiàn)典型而對(duì)稱(chēng)的標(biāo)化熔解曲線(xiàn)和熔解峰，為野生型SF3B1基因標(biāo)本。2例突變分別見(jiàn)于1例RARS患者和1例RCMD-RS患者。

2.2 DNA 測(cè)序結(jié)果

對(duì)30例標(biāo)本進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示，具有異常熔解曲線(xiàn)的2例標(biāo)本中1例為K666M雜合性突變，即 c.1997A＞T(AAG→ATG);1例為K700E雜合性突變，即c.2098A＞G(AAA→GAA)，其余例標(biāo)本均為野生型。見(jiàn)圖2。

2.3 HRMA法的靈敏度

我們對(duì)1例具有SF3B1 K700E突變的MDS標(biāo)本的突變PCR產(chǎn)物和野生型PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，然后應(yīng)用野生型克隆對(duì)突變型克隆進(jìn)行稀釋(分別含突變型100%、50%、25%、10%、5%、2%、1%和 0%)，HRMA 檢測(cè)SF3B1 K700E突變的靈敏度為5%，即0.05(圖3)。

圖1 30例骨髓增生異常綜合征患者SF3B1基因突變的高分辨熔解曲線(xiàn)Fig 1 High-resolution melting analysis results of SF3B1 mutations in 30 patients with myelodysplastic syndrome

圖2 骨髓增生異常綜合征患者中K666M與K700E突變的測(cè)序結(jié)果Fig 2 Sequencing results of K666M and K700E mutations in patients with myelodysplastic syndrome

圖3 高分辨熔解曲線(xiàn)分析檢測(cè)SF3B1基因突變的靈敏度Fig 3 Sensitivity of high-resolution melting analysis in detecting SF3B1 mutations

3 討論

RNA剪接是一個(gè)多步驟依次進(jìn)行的生物過(guò)程，剪接體在這個(gè)過(guò)程中起著重要的作用，其由5個(gè)小核糖核蛋白(snRNP)復(fù)合體組成，包括U1、U2、U4、U5、U6 和50 ～100 種非 snRNP［15］。其中，小核糖核蛋白 U2由剪接因子 3A(SF3A)、剪接因子 3B(SF3B)及12 S RNA 亞基組成［15］，SF3B1 參與剪接體組裝的早期過(guò)程。目前發(fā)現(xiàn)SF3B1基因突變主要為K700E突變，此外還有E622、H662、K666等突變，主要見(jiàn)于骨髓中以環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞為特征的MDS亞型［5－9］。研究發(fā)現(xiàn)，伴有 SF3B1 基因突變者的總體生存率高于未突變者，且向急性髓系白血病轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)率較未突變者低［6－7］。

目前，DNA直接測(cè)序法常被用來(lái)檢測(cè)SF3B1基因突變［5－8］。本研究中，我們建立了一種快速的、高通量的HRMA技術(shù)來(lái)檢測(cè)SF3B1基因突變。與其他技術(shù)相比，HRMA技術(shù)成本低、省時(shí)、省力，無(wú)需序列特異性探針，且一個(gè)人一次能獨(dú)立完成多達(dá)96個(gè)DNA標(biāo)本的突變檢測(cè)。只有被HRMA檢測(cè)出的突變樣本才需要進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證。從提取基因組DNA開(kāi)始到完成突變檢測(cè)分析過(guò)程，HRMA只需2.5 h，而直接DNA測(cè)序法整個(gè)過(guò)程需要4 d。此外，PCR產(chǎn)物可以直接進(jìn)行HRMA突變檢測(cè)，無(wú)需后續(xù)處理;并且，HRMA的靈敏度能達(dá)到0.05。雖然我們初步檢測(cè)到SF3B1基因的突變率(6%)低于其他文獻(xiàn)的報(bào)道［5－8］，這有可能由于我們篩查的骨髓標(biāo)本中以環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞為特征的MDS亞型類(lèi)比較少，而不是由應(yīng)用的技術(shù)所導(dǎo)致。本研究結(jié)果顯示，3例骨髓中伴有環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞增多的患者中存在2例SF3B1基因突變，即SF3B1基因突變常見(jiàn)于RARS與RCMD-RS這兩類(lèi)MDS亞型，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致。

總之，我們建立了一種高通量、快速、特異和靈敏度高的篩選SF3B1基因突變的HRMA方法，該方法更適用于對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行SF3B1基因突變的分子診斷。

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