HBsAg與抗HBs雙陽患者基因突變對HBsAg抗原性改變的研究進展

王 珊 綜述， 王 蕾 審校

(1.蘇州大學，江蘇蘇州215006;2.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院檢驗科，上海200032)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)可引起人類發(fā)生急、慢性HBV感染，其中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是診斷HBV感染的重要標志。乙型肝炎表面抗體(抗HBs)則通常在HBsAg轉陰后數周，經過一段時間的窗口期血清內才會出現?？笻Bs可用來預防HBV的再感染，但有賴于HBsAg與抗HBs之間的相互作用，因此HBsAg抗原性的變化可直接影響HBV感染后的診斷和治療。但近年來國內外有關抗HBs和HBsAg共存的臨床研究報告逐漸增多［1-3］，乙型肝炎患者和無癥狀HBV攜帶者均會發(fā)生抗HBs和HBsAg同時陽性的現象(簡稱雙陽現象)。關于HBsAg與抗HBs共存機制，許多研究表明與HBsAg抗原性發(fā)生改變有關，因此我們針對HBsAg的抗原性改變與雙陽現象的關系做一綜述。

一、HBV基因突變與HBsAg抗原性改變

HBV基因組全長約3 200 bp，是部分雙鏈的環(huán)狀DNA，其負鏈核苷酸序列有4個相互重疊的開放讀碼框(ORF)，分別為S、C、P和X區(qū)。HBV自身編碼的DNA聚合酶具有逆轉錄酶功能，可由前基因組RNA反轉錄合成子代病毒基因組，但逆轉錄酶缺乏3'-5'的校對功能，造成子代HBV基因組與模板之間存在一定的差異，在復制過程中極易產生突變，高復制水平的個體每天至少發(fā)生1010次點突變，其突變率遠高于其他DNA病毒［4］。HBV基因突變可導致其編碼區(qū)內的氨基酸發(fā)生改變。氨基酸的改變可能會影響抗原的空間構象，且氨基酸的替代位置和特性對蛋白質構象的影響也有差異。

(一)前 S區(qū)基因突變對 HBsAg抗原性的影響

S區(qū)分為前S1、前S2和S區(qū)，S區(qū)基因編碼主蛋白，即HBsAg。前S2和S區(qū)基因共同編碼中蛋白，前Sl、前S2和S區(qū)基因共同編碼大蛋白。HBsAg由226個氨基酸組成，攜帶全部抗原反應性;中蛋白是在主蛋白的氨基端擴加55個氨基酸，擴加部分為前S2蛋白;大蛋白是在中蛋白的氨基端再擴加108～119個氨基酸，擴加部分為前S1蛋白。

前S區(qū)基因突變常見的為前S區(qū)的缺失。前S2起始密碼缺失可使前S2蛋白不能表達。前S2突變的另一熱點是前S2蛋白8～22位氨基酸附近的缺失突變，該突變可影響B(tài)細胞的識別表位。這種缺失突變株普遍存在于抗HBs陽性的慢性HBV感染者中，并成為優(yōu)勢株，與逃避機體免疫反應有關［5-6］。

前S1蛋白含有影響HBsAg分泌的調節(jié)序列，其第63～87位氨基酸或83～87位氨基酸缺失可下調HBsAg分泌。前S1突變株以前S1蛋白C端183位氨基酸缺失突變?yōu)槎嘁?，這種突變因影響HBsAg正常分泌，并使異常大蛋白發(fā)生蓄積而引起肝細胞病變。前S1區(qū)基因起始密碼下游第230位核苷酸可因突變形成終止密碼，并影響前S2起始密碼，可使HBV逃避核苷類藥物治療和宿主免疫清除。

Huang等［7］對 HBsAg和抗 HBs同時陽性的慢性乙型肝炎患者前S/S區(qū)測序發(fā)現，前S區(qū)基因缺失在雙陽組與單純HBsAg陽性的對照組之間差異有統(tǒng)計學意義，Wang等［8］的研究也有相同的結果，即前S區(qū)基因缺失在雙陽患者明顯多于單純HBsAg陽性者，因此推論可能前S區(qū)基因缺失與HBsAg和抗HBs同時存在密切相關。

(二)S區(qū)基因突變對HBsAg抗原性的影響

HBsAg由S區(qū)基因編碼，其優(yōu)勢共同抗原表位a決定簇位于高度保守的124～147位氨基酸親水區(qū)，是HBV各血清亞型的共同決定簇，在所有血清亞型中均存在［9］。a決定簇借2對二硫鍵形成2個環(huán)狀結構，其獨特的空間構象使其具有極強的抗原性，機體產生的保護性抗體中90%以上針對a決定簇，該部位氨基酸的替代造成的蛋白結構改變是HBsAg抗原性漂移產生的分子基礎?？乖肿拥牧Ⅲw結構是決定抗原與淋巴細胞抗原受體結合引起免疫應答的關鍵，也是決定抗原與抗體結合出現各種免疫反應的物質基礎。若抗原立體結構發(fā)生改變，可使抗原性改變或喪失。HBsAg蛋白結構中發(fā)生氨基酸替代后，一級結構發(fā)生改變，導致維持和穩(wěn)定蛋白質三級空間結構的各種氨基酸側鏈之間的作用平衡被打破，而形成新的平衡和空間構象。

目前報道常見的HBV S區(qū)編碼的氨基酸突變株有G145R(G→R，即甘氨酸→精氨酸)、I126T/S(異亮氨酸→蘇氨酸/絲氨酸)、M133T(蛋氨酸→蘇氨酸)等，其中國外文獻報道最多的為145位點突變，而Wang等［3］的研究中發(fā)現C基因型乙型肝炎患者中126位點突變最常見。日本學者Ren等［10］對24例慢性感染的乙型肝炎患者的HBV S區(qū)測序發(fā)現，在7例C型患者中6例出現I126T(異亮氨酸→蘇氨酸)和S143T(絲氨酸→蘇氨酸)突變。模擬HBV S區(qū)a決定簇內氨基酸的3D 空間結構，結果顯示126、129、140、143 位點暴露于HBsAg空間結構的表面。但他們認為I126T突變對HBsAg抗原性的影響比較大，首先I126T突變在進化樹中位于基因型C分支的根源;其次蛋白或多肽的抗原性與其親水性、等電點及構象密切相關，一般親水性高的多肽抗原性強，親水性低的多肽抗原性弱。由于蘇氨酸與被替代的異亮氨酸化學性質差異大，蘇氨酸的親水值為－0.7，而異亮氨酸的親水值為4.5，絲氨酸的親水值為－0.8，與蘇氨酸相近。因此I126T(異亮氨酸→蘇氨酸)的突變造成HBsAg抗原性明顯減弱，而S143T(絲氨酸→蘇氨酸)突變使HBsAg抗原性改變不大，而且出現I126T突變的患者預后較差。

Qiu等［11］對1例C基因型的慢性乙型肝炎患者的HBsAg編碼區(qū)進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增，從其克隆株中選取3株126位點分別為異亮氨酸(I)、蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)的菌株，并通過定點誘導法構建126位點為丙氨酸(A)的突變株。他們發(fā)現不同的HBsAg突變株可在同一患者體內共存，且126S突變的HBsAg的抗原性明顯降低，而126 I、126T、126A的HBsAg與抗體反應的水平相近。免疫熒光染色發(fā)現細胞內4種突變HBsAg的表達水平相近，因此Qiu等認為126S突變的HBsAg抗原性明顯減低，可能導致慢性乙型肝炎感染中的免疫逃逸。由于I與S的親水值相差很大，發(fā)生該突變后可使HBsAg的抗原性下降。但126T突變株抗原性的變化與Ren等［10］的研究不一致，可能與Qiu的研究例數只有1例有關。

Tian等［12］通過定點誘導法構建了HBV S基因區(qū)內 P120T、C121S、K122I、T123N、G145R 突變株并誘導HBsAg表達檢測其抗原性的變化。結果顯示P120T突變株與野生型HBsAg相比，與市售試劑盒反應性相近;C121S、K122I、T123N、G145R突變對HBsAg抗原性的影響較大，與抗體反應均明顯降低。因此他們認為121～123位點氨基酸的改變對HBsAg抗原性有較大影響。

(三)P區(qū)基因突變對HBsAg抗原性的影響

P區(qū)是HBV基因中最長的ORF，位于第2 375-0-1 621位核苷酸之間。其開始段與C區(qū)重疊，中間與S區(qū)重疊，末段與X區(qū)重疊。P區(qū)某些位點的突變可影響HBV前基因組RNA的包裝，從而影響病毒復制。

因部分P基因區(qū)與S基因區(qū)重疊，某種S或P基因的突變可引起相應重疊基因的突變［13-15］，很多研究者也已經開始關注P區(qū)突變對于S區(qū)的影響，P區(qū)的突變也可能影響HBsAg的表達、分泌和特性。Torresi等［13］研究發(fā)現拉米夫定耐藥引起的突變會使HBsAg a決定簇下游相應位點氨基酸發(fā)生改變，導致HBsAg的抗原性降低，與抗體識別和結合的能力也發(fā)生改變。同樣，Torresi認為核苷類似物的廣泛應用可引起HBsAg突變，而疫苗誘導產生的抗體與突變抗原的結合很弱，這可能也是疫苗接種者感染的原因之一。其他研究也指出長期應用核苷類似物可引起S基因的突變［16］。國內學者對拉米夫定治療期間隱匿性慢性乙型肝炎與HBV重疊基因突變的相關性進行研究，結果發(fā)現240例乙型肝炎患者經拉米夫定治療36個月后16例患者HBsAg陰性，而HBeAg和HBV DNA仍呈陽性。測序發(fā)現S區(qū)a決定簇存在氨基酸突變，P區(qū)中YMDD基序出現YIDD突變。他們認為在長期拉米夫定治療期間檢測不到HBsAg，可能因HBsAg結構蛋白發(fā)生突變，與YMDD突變協(xié)同作用，使HBsAg的抗原性改變所致［17］。

Ogura等［18］對42例隱匿性慢性乙型肝炎患者HBV S基因區(qū)和與之重疊的P基因區(qū)進行了核苷酸序列分析，發(fā)現24%的患者在a決定簇發(fā)生突變，而這些突變發(fā)生后沒有檢測到DNA聚合酶主要催化活性區(qū)的改變，說明該突變可能不會影響P區(qū)病毒復制的功能。但有報道［19］顯示重疊S基因突變會增強耐藥突變株的復制活性。

(四)C區(qū)及X區(qū)基因突變對HBsAg抗原性的影響

C區(qū)包括前C區(qū)和C區(qū)。前C區(qū)基因經典的突變是ntGl 896A(即83位氨基酸突變)，可使前C區(qū)基因第28密碼TGG轉變?yōu)榻K止密碼TAC，導致前C區(qū)mRNA翻譯為HBeAg前體蛋白中斷，HBeAg合成終止。C區(qū)最常見的突變?yōu)榛竞诵膯幼?BCP)內ntAl 762T、ntGl 764A。這種BCP雙突變影響細胞內轉錄因子與該區(qū)的特異性結合，可降低前C mRNA的轉錄效果，導致HBeAg水平下降或形成血清HBeAg陰性。關于C區(qū)基因突變對HBsAg的影響，Chen等［20］對乙型肝炎患者HBV全基因序列檢測發(fā)現，雙陽患者BCP內雙突變高于單純HBsAg陽性對照組，差異有統(tǒng)計學意義，但未見其他相似報道，需進一步研究來證實C區(qū)基因突變對HBsAg抗原性的影響。

HBV DNA ntl 763-ntl 770和ntl 753-ntl 772缺失均可使X區(qū)讀碼提前終止。該區(qū)編碼產物HBxAg是致敏細胞毒性T細胞(CTL)攻擊的靶抗原之一，血清可溶性HBxAg可調節(jié)CTL對靶細胞的免疫識別，因此 X區(qū)突變可能不利于清除HBV。至于X區(qū)基因突變對HBsAg有何影響，目前尚未見報道，值得進一步關注。

二、糖基化與HBsAg抗原性改變

蛋白翻譯后的修飾狀態(tài)可反映其表達細胞的胞內環(huán)境，但受病毒感染、細胞惡性化或其他環(huán)境因素的影響，胞內代謝發(fā)生改變時會導致翻譯后修飾改變。糖基化是細胞表面最常見也是最重要的一種翻譯后修飾，不僅增強抗原耐受蛋白酶水解能力，還可在不改變基因水平情況下，導致抗原表位結構改變，引起抗原改變或生成新表位［21］。

機體對抗原刺激的免疫應答最終均由免疫分子所介導。免疫分子包括免疫球蛋白、細胞因子、補體等。這些分子中有些為細胞膜蛋白，有些為分泌性蛋白。已知絕大部分細胞膜蛋白與分泌性蛋白屬糖蛋白。因此，蛋白質的糖基化必然影響免疫分子的結構與功能，從而影響機體對抗原的應答反應。

許多病毒抗原都有糖基化的現象［22-23］。Ramanujam等［22］對風疹病毒E1蛋白3個糖基化位點N(天冬酰胺)76、N177、N209進行定點誘導突變，研究發(fā)現失去N-糖基的N76I、N209I及二者聯合的突變株轉染細胞后檢測不到感染性的風疹病毒衣殼，而在野生型和N177I突變株感染細胞中仍可檢測到，表明N76I、N209I對風疹病毒的可變性至關重要。除此之外，人流感病毒血凝素的N-糖基化位點突變分析表明N123、N149位點的糖基化在決定病毒生長特性方面起重要作用;丙型肝炎病毒E1糖蛋白在N196、N305位點的突變明顯降低了E1蛋白與E2蛋白共價結合的效率;2型登革熱病毒中N-糖基化位點的突變會導致其生長受到限制。

在HBV感染中，其3種表面蛋白均為被糖基化修飾的糖蛋白，他們是在人肝細胞的粗面內質網和高爾基體中被翻譯后修飾而糖基化的，因此和肝細胞自身合成蛋白的糖基化修飾相似。這些糖結構不僅不能被機體免疫系統(tǒng)識別，還能阻礙對肝細胞膜上病毒蛋白抗原表位識別，使誘導特異性CTL應答失敗，導致免疫逃逸或耐受，從而使HBV感染慢性化。HBsAg表達基因中有3個潛在的N-糖基化位點(氨基酸序列必須為NXT或NXS)，分別位于前S2開放讀碼起第4(隨后氨基酸序列為NTT)、第59(NHS)、第146(NCT)位，已經明確第146位的天冬酰胺上連接著復雜的糖基［24］。

Wu等［25］采用定點誘導突變的方法構建了HBsAg K122I、T123N、A159G、K160N 突變株，蛋白表達后經蛋白免疫印跡法(Western blot)發(fā)現T123N和K160N突變抗原蛋白顯示相對分子質量為26 000、29 000、32 000 3個條帶，野生型抗原和K122I、A159G突變抗原只顯示相對分子質量為26 000、29 000的2個條帶，且前一組中29 000條帶顯色深，經過衣霉素(糖基化抑制劑)處理后，蛋白印跡中只顯示26 000條帶。因此他們推測26 000、29 000條帶可能分別是不伴或伴糖基化的HBsAg，32 000可能是123、160位點突變后產生的額外的HBsAg糖基化形式。

劉文軍等［26］利用末端重疊PCR和定點突變技術，獲得了去除N-多糖結構的HBsAg S區(qū)突變基因，研究發(fā)現無糖HBsAg與糖化HBsAg的抗原表位明顯不同。他們認為HBsAg的N-糖基在第146位Asn位置恰好位于a決定簇的氨基酸序列內，糖基化很可能掩蓋了a決定簇。因此，當去除146位連接的糖基后，失去了原有的活性位點而暴露出新的活性位點，引起 HBsAg抗原性的改變。

三、小結

機體感染HBV后產生HBsAg，在機體的免疫壓力、藥物或其他因素的作用下可發(fā)生基因突變。當HBV基因發(fā)生突變時，其編碼的氨基酸發(fā)生改變或影響蛋白翻譯后的修飾，導致HBsAg抗原性發(fā)生改變，原先產生的抗體無法與突變后的抗原結合，出現HBsAg和抗HBs共存。至于蛋白翻譯后的其他修飾，如磷酸化、甲基化等對HBsAg抗原性影響的報道目前還很少。此外，Rodriguez-Frias等［27］發(fā)現HBV氨基酸突變在慢性肝炎、肝硬化、肝癌中的發(fā)生率逐漸增高，并與疾病發(fā)展的程度相關，即疾病越嚴重者其氨基酸突變的數量越多。因此HBsAg突變不僅與雙陽現象有關，還與疾病的進展、轉歸密切相關。我們應對HBsAg突變的具體機制進行更深入的探究，為臨床對乙型肝炎相關疾病進行準確和及時的診治提供有價值的信息。

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