直接免疫熒光法病毒抗原測定在呼吸道感染性疾病診斷中的應(yīng)用

俞小衛(wèi)， 王亞楠， 程寶金， 馬玲娣

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院呼吸科，江蘇常州213003;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院兒科，江蘇常州213003;3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇常州213003)

上呼吸道的感染大多是由病毒感染所引起，特別是在兒童、青少年階段，病毒感染較為頻繁［1］。隨著2003年SARS病毒的大肆傳染和2009年甲型流感的爆發(fā)至今，我們越來越意識到呼吸道病毒檢測的重要性。目前，呼吸道病毒檢測的方法有很多，但都存在著各種各樣的不足，難以在臨床檢查中推廣。多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)對于呼吸道感染很少進(jìn)行病原學(xué)檢測，特別是病毒的檢測，而是直接使用抗菌藥物進(jìn)行治療，從而造成了抗菌藥物的濫用，不但延誤了病毒性疾病的診治，而且無形中增加了患者的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。為了解呼吸道感染中病毒感染的情況，我們采用直接免疫熒光法檢測了呼吸道感染患者7種病毒抗原［包括呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、流感病毒A(InfA)、流感病毒 B(InfB)和副流感病毒1、2、3型(PIV1、2、3)］。

材料和方法

一、標(biāo)本來源

2010年12月至2011年5月在常州市第二人民醫(yī)院住院的呼吸道感染患者762例，其中成人38例(男25例，女13例，年齡21～83歲)、兒童724例(男439例，女285例，年齡1 d～17歲)。

二、試劑與設(shè)備

1.檢測試劑 呼吸道病毒抗原檢測試劑盒［美國Diagnostic Hybrids公司，已通過美國藥品食品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)證用于體外診斷］，包括單克隆熒光標(biāo)記的7種抗體(RSV、ADV、InfA、InfB以及PIV1、2、3)，濃縮洗滌液磷酸鹽緩沖液(PBS，40×)，封閉液，抗原對照玻片，另外需配備冷丙酮。

2.檢測設(shè)備 熒光顯微鏡，37℃水浴箱，渦旋振蕩器等。

3.檢測材料 絨植拭子、載玻片、蓋玻片等。

三、方法

1.標(biāo)本的采集 將配套的絨植拭子經(jīng)鼻腔插入到達(dá)鼻咽部約7～8 cm。來回旋轉(zhuǎn)2～3次后迅速抽出拭子，放入加有3 mL PBS(10×)的塑料試管中，蓋上蓋子送檢。

2.標(biāo)本處理 將絨植拭子標(biāo)本在漩渦混勻器上輕微混勻3下(約30 s)，見渾濁后去掉絨植拭子。以700×g離心10 min。棄去上清液(留約100～150μL)，吸管吹打混勻，形成混濁細(xì)胞懸浮液。

3.標(biāo)本制片 標(biāo)本點(diǎn)樣在載玻片上(約10～15μL)，電吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)下風(fēng)干10～15 min至干燥，浸沒在冷丙酮中固定10 min，取出晾干。

4.標(biāo)本反應(yīng) 每份標(biāo)本分別加D3試劑1滴(25μL)，必須完全覆蓋待測標(biāo)本。將載玻片放在濕盒中置于37℃培養(yǎng)箱(或放在泡沫上置于37℃水浴箱)孵育15～30 min。載玻片用PBS沖洗1次，后浸沒在PBS中洗2次(PBS不能重復(fù)使用)。

5.標(biāo)本觀察 玻片中央加1滴封閉液，蓋上蓋玻片。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、陽性結(jié)果

熒光顯微鏡下顯示蘋果綠熒光的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，而被Evans藍(lán)染成紅色的細(xì)胞為陰性細(xì)胞。當(dāng)放大倍數(shù)為200倍時(shí)，在視野中找到≥2個(gè)陽性細(xì)胞判為標(biāo)本陽性。見圖1、圖2。

圖1 呼吸道RSV感染熒光顯微鏡下圖像

圖2 呼吸道病毒陰性熒光顯微鏡下圖像

二、7種病毒的陽性檢出率

在762例患者中，陽性例數(shù)為264例，陽性檢出率為34.65%。其中陽性率最高的是RSV(70.45%)，其次為PIV3(10.98%)。見表1。

三、不同季節(jié)呼吸道病毒感染情況分析

經(jīng)χ2檢驗(yàn)，不同季節(jié)呼吸道病毒的感染率不同(P＜0.05)。由于本研究標(biāo)本在12月～5月間采取，經(jīng)歷了冬季、春季。隨著氣溫的升高，病毒的檢出率逐漸降低，冬季要明顯高于春季。另外，雖然隨著氣候變暖，RSV的檢出率降低，但在7種病毒中仍占主要地位;PIV3檢出率增加的幅度較大。見表2。

表1 7種病毒的陽性檢出率

表2 不同季節(jié)7種病毒的檢出情況 ［例(%)］

四、18歲以下不同年齡組患兒呼吸道病毒的感染情況

經(jīng)χ2檢驗(yàn)，不同年齡組患兒的感染率不同(P＜0.05)，其中6個(gè)月以內(nèi)嬰兒的感染率較高，之后隨年齡的增長而逐漸降低。由于成人標(biāo)本數(shù)較少，因此不做此方面的統(tǒng)計(jì)。見表3。

五、兒科常見臨床診斷與病毒感染的情況

從構(gòu)成比看，呼吸道病毒感染在喘息性支氣管肺炎、毛細(xì)支氣管炎、支氣管肺炎和一般肺炎較高，其檢測例數(shù)也比較多。毛細(xì)支氣管炎的陽性檢出率最高，達(dá)64.21%，其次為喘息性支氣管肺炎，占45.91%。見表4。

表3 18歲以下不同年齡組患兒呼吸道病毒的檢出率

表4 臨床診斷與呼吸道病毒感染

討 論

病原學(xué)檢測對于呼吸道感染的診斷和治療極為重要，有文獻(xiàn)指出95%的上呼吸道感染和大部分的下呼吸道感染是由細(xì)菌以外的病原體引起，其中病毒最為常見［2］。因此進(jìn)行早期快速的呼吸道病毒檢測十分必要。有研究證明呼吸道病毒抗原檢測陽性結(jié)果的患者接受抗菌藥物治療的時(shí)間明顯縮短，這樣即可以減少抗菌藥物的使用，又使住院時(shí)間縮短［3-4］。

對于呼吸道病毒的檢測，目前主要的方法有分離培養(yǎng)鑒定、核酸檢測以及抗原抗體的檢測。FDA認(rèn)為，病毒感染需用免疫熒光檢測、病毒培養(yǎng)或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來確認(rèn)，原因是其他方法的陰性結(jié)果無法排除流感病毒感染。就現(xiàn)有檢測方法來看各有優(yōu)劣，分離培養(yǎng)雖是金標(biāo)法，但此方法耗時(shí)較長，不利于早期指導(dǎo)臨床治療;PCR雖然敏感性高［5］，但其對實(shí)驗(yàn)室的要求高，成本也高，難以普及?？贵w的檢測目前應(yīng)用較廣，但由于IgM抗體一般是在呼吸道病毒感染6 d以后才能檢測到，IgG抗體一般在治療后才會出現(xiàn)，檢測周期長，臨床應(yīng)用不便［6］。相比較之下直接免疫熒光法抗原檢測更為簡便、快速且檢測成本較低，利于普及。

在本研究檢測的患者中，兒童占95.01%。而在所有感染者中，以RSV感染最為多見，占陽性病例的70.45%，此結(jié)果與國內(nèi)外的報(bào)道一致［7-8］。不同年齡組患者的感染率也有所差異，有文獻(xiàn)指出，3歲以內(nèi)兒童的陽性檢出率較3歲以上兒童高2.4倍之多，因此對于此年齡段兒童呼吸道病毒感染的確診較為重要［9-11］。本研究對3歲以內(nèi)患兒進(jìn)行繼續(xù)分析，6個(gè)月以內(nèi)的嬰兒感染率較高，達(dá)44.18%，可能與這個(gè)時(shí)期嬰幼兒免疫功能低下有關(guān)，因此對6個(gè)月以內(nèi)的患兒要重點(diǎn)關(guān)注。

另外，從兒科常見臨床診斷與病毒檢測的結(jié)果來看，毛細(xì)支氣管炎、喘息性支氣管肺炎陽性檢出率較高，而且多數(shù)患者在檢測呼吸道病毒感染之后使用了抗病毒的藥物進(jìn)行治療，病情得到及時(shí)的控制。因此，當(dāng)患者做此診斷時(shí)，是否為呼吸道病毒感染可作為首先考慮的方向之一。

成人下呼吸道病毒感染極易被忽視。本研究有1例患者因肺間質(zhì)纖維化入院，住院期間受涼合并肺炎，經(jīng)抗菌藥物治療數(shù)日未見好轉(zhuǎn)，后進(jìn)行病毒抗原檢測，為InfA陽性，改用抗病毒藥物治療后痊愈。有研究表明下呼吸道感染患者病毒檢測陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康人，提示對住院下呼吸道感染患者有必要開展呼吸道病毒的常規(guī)檢測［12］。

本研究結(jié)果表明，不同的季節(jié)呼吸道病毒感染的情況也不同，冬季明顯高于春季。春季陽性檢出率為25.45%，而冬季陽性檢出率高達(dá)44.23%。冬春兩季RSV的檢出率均最高，但除RSV以外的6種病毒中，InfA在冬季的陽性檢出率較高，而在春季PIV3的陽性檢出率較高，提示在冬季初春病毒感染的高發(fā)時(shí)節(jié)，要側(cè)重于RSV以及InfA感染的防治。隨著氣溫升高，RSV的檢出率逐漸降低，PIV3的檢出率逐漸升高。

綜上所述，直接免疫熒光法病毒抗原測定簡單、快速、實(shí)用，不但可用于呼吸道感染病毒病原體的早期快速診斷，還可用于各季節(jié)病毒流行的動態(tài)監(jiān)測。

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