神經(jīng)組織工程修復(fù)脊髓損傷的研究進(jìn)展（天然生物支架修復(fù)脊髓損傷）

馬犇，彭寶淦

（1.徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州 221004；2.武警總醫(yī)院，北京 100039）

脊髓損傷（Spinal Cord Injury SCI）是一種以脊髓損傷平面以下感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能喪失、大小便失禁、性功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床上以創(chuàng)傷引起的脊髓損傷常見(jiàn)。脊髓損傷的康復(fù)是當(dāng)今仍未解決的醫(yī)學(xué)難題，究其原因是人類(lèi)中樞神經(jīng)只具有極其微弱的再生能力，多種病理生理活動(dòng)及多種代謝產(chǎn)物參與導(dǎo)致?lián)p傷部位的微環(huán)境變化，不利于神經(jīng)軸突的再生長(zhǎng)造成。

近年采用細(xì)胞移植、組織工程、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等治療方法修復(fù)脊髓損傷，取得了一定進(jìn)展。這些研究在促進(jìn)損傷神經(jīng)再生能力及改變脊髓損傷部位的微環(huán)境做了嘗試，其中神經(jīng)組織工程技術(shù)的發(fā)展，在修復(fù)脊髓損傷，促進(jìn)功能康復(fù)取得了較大的進(jìn)步。神經(jīng)組織工程是以支架為載體載入種子細(xì)胞進(jìn)入損傷部位或植入新的組織，以達(dá)到修復(fù)損傷的神經(jīng)組織的目的。種子細(xì)胞目前報(bào)道有神經(jīng)干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、許旺細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞等[1-3]。支架是神經(jīng)組織工程里不可或缺主體，其主要作用能橋接損傷的脊髓，為脊髓中神經(jīng)軸突生長(zhǎng)橋接提供空間和營(yíng)養(yǎng)，還能作為種子細(xì)胞移植治療神經(jīng)損傷的土壤，引導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、遷移以及凋亡，從而促進(jìn)脊髓神經(jīng)的再生。完美的支架應(yīng)該具備良好的生物相容性及支架降解產(chǎn)物無(wú)毒性，良好的機(jī)械支撐力，適合軸突生長(zhǎng)的孔隙率及三維立體的空隙結(jié)構(gòu)，良好的可塑性及粘附力[4]。作為細(xì)胞移植的載體，按構(gòu)成支架的材料的屬性可以將支架分為天然生物支架（天然生物材料是在自然條件下生成的生物材料，主要包括天然纖維、生物體組織、結(jié)構(gòu)蛋白和生物礦物等材料[3]），人工材料合成支架（相對(duì)于“天然材料”而言。自然界以化合物形式存在的、不能直接使用的，或者自然界不存在的，需要經(jīng)過(guò)人為加工或合成后才能使用的材料[1-4]），及復(fù)合型支架（基于天然材料和人工材料混合而成的支架）3大類(lèi)。天然生物支架因具有與宿主的良好的生物相容性、降解產(chǎn)物無(wú)毒性及良好的粘附力成為研究的熱點(diǎn)，去細(xì)胞組織支架作為天然生物支架重要分支，在細(xì)胞信號(hào)識(shí)別，促進(jìn)細(xì)胞的粘附、增殖和分化等方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)就天然生物支架修復(fù)脊髓損傷的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 天然生物材料合成支架在脊髓損傷修復(fù)中的研究

天然生物材料，主要包括天然纖維、生物體組織、結(jié)構(gòu)蛋白和生物礦物等材料[3]。天然生物支架包括基于天然材料合成的支架、天然的組織及天然組織的衍生支架。天然生物材料合成支架常是運(yùn)用天然生物材料合成的天然可降解的管狀，或者打印成條狀通道結(jié)構(gòu)的高孔隙率的支架。天然材料有透明質(zhì)酸、膠原、纖維蛋白、藻酸鹽、殼聚糖、聚羥基丁酸酯及甲基纖維素水凝膠等，他們既可以單獨(dú)作為支架，也可以作為天然材料合成支架。因而這些天然材料及其合成的天然生物支架具有良好的生物相容性、細(xì)胞親和性和可降解性，且降解產(chǎn)物無(wú)毒性，能較好地促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖[3，4]。

透明質(zhì)酸廣泛存在與細(xì)胞外組織間隙中，可以很大程度減少損傷部位的淋巴細(xì)胞遷移及分化，阻止其炎癥趨向性，能阻止炎癥細(xì)胞的吞噬作用而達(dá)到減輕脊髓損傷的二次損傷，促進(jìn)創(chuàng)傷后的脊髓神經(jīng)組織再生[5，6]。然而透明質(zhì)酸制成的支架對(duì)種子細(xì)胞的粘附能力較弱，這在近期的研究中的到改善，有學(xué)者將層粘連蛋白Laminin（LA）加入透明質(zhì)酸制成支架，或者在支架上涂上賴(lài)氨酸涂層[7]，使其粘連能力得到很大改善。然而由于透明質(zhì)酸支架的支撐強(qiáng)度較弱，以及其很高的降解率沒(méi)有得到改善，現(xiàn)已較少運(yùn)用到脊髓損傷的修復(fù)。

膠原（collagen）是人體和脊椎動(dòng)物的主要結(jié)構(gòu)蛋白，作為重要的細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）成分，具有細(xì)胞黏附信號(hào)的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基因序列，從而促進(jìn)種子細(xì)胞在支架上得黏附、促進(jìn)種子細(xì)胞的分化及遷移，機(jī)體的軸突有利于附著在膠原支架上從而有利于軸突的再生[8]。在脊髓損傷部位膠原還可攜帶生長(zhǎng)因子參與調(diào)節(jié)局部微環(huán)境和減少瘢痕組織形成，有利于損傷的恢復(fù)[9]。但這些再生的神經(jīng)纖維是雜亂無(wú)章的，膠原制成的支架不能引導(dǎo)再生的纖維通過(guò)損傷部位而達(dá)到尾端組織而形成完整的神經(jīng)通路[10]，也有文獻(xiàn)報(bào)道在損傷部位過(guò)高膠原濃度，會(huì)阻礙神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)[11]。

其他用于制成支架修復(fù)脊髓損傷的天然材料還包括藻酸鹽、殼聚糖及水凝膠等，還有一些基于蛋白：如纖維素蛋白的合成支架也被嘗試用于修復(fù)脊髓損傷[12，13]。這些研究顯示基于天然材料合成的支架相比于人工材料合成的支架有提高種子細(xì)胞的粘附能力，良好地生物相容性及降解無(wú)毒性，延長(zhǎng)種子細(xì)胞的體內(nèi)存活時(shí)間，提高種子細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化率，較好的促進(jìn)組織再生及功能康復(fù)等優(yōu)勢(shì)[1]。有些學(xué)者發(fā)現(xiàn)原始材料直接用于修復(fù)時(shí)機(jī)械支撐力弱，不能引導(dǎo)再生的神經(jīng)組織有效通過(guò)損傷區(qū)，降解速率與機(jī)體康復(fù)不同步等缺陷[1，13]，如果以天然材料重新塑形，合成支架也會(huì)面臨支架硬度，降解度不匹配組織修復(fù)的進(jìn)度，且孔隙率很難完全匹配神經(jīng)軸突的再生長(zhǎng)。面對(duì)這些問(wèn)題，天然材料合成的支架要修復(fù)脊髓損傷還需要很多改進(jìn)。

2 去細(xì)胞組織支架修復(fù)脊髓損傷的優(yōu)勢(shì)

綜上所述，基于天然材料合成支架存在不同程度的缺陷，不能很好解決脊髓損傷的修復(fù)問(wèn)題。近年來(lái)去細(xì)胞組織支架成為人們研究的熱點(diǎn)，去細(xì)胞支架是生物組織經(jīng)人工萃取及去細(xì)胞等處理而來(lái)的的天然組織支架，被廣泛的用于天然生物材料合成支架的替代而用于組織修復(fù)研究中[1-4]。去細(xì)胞組織支架因具備天然組織及天然生物原料及其合成支架的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也具備高仿真三維立體結(jié)構(gòu)，對(duì)損傷部位的機(jī)械支撐力適中，降解率匹配組織再生修復(fù)速率等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為近期研究的熱點(diǎn)。將組織中的細(xì)胞蛋白質(zhì)等物質(zhì)用化學(xué)方法去除，得到無(wú)抗原的天然的去細(xì)胞組織支架，這些支架具備生物相容性好，免疫原性低，且制作方便，移植到體內(nèi)能為種子細(xì)胞提供盡可能接近體內(nèi)環(huán)境的生長(zhǎng)空間[1-4]。去細(xì)胞組織技術(shù)在皮膚病、泌尿系統(tǒng)損傷，消化疾病，心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病，肌肉等組織修復(fù)方面已有廣泛應(yīng)用[1-4，14-16]。

Sondell等17于1998年率先報(bào)道了用大鼠的去細(xì)胞坐骨神經(jīng)支架修復(fù)坐骨神經(jīng)損傷，取得了不錯(cuò)的效果。新鮮的坐骨神經(jīng)被取下后，采用Triton X-100和脫氧膽酸鈉化學(xué)萃取的方式去除掉坐骨神經(jīng)組織中的細(xì)胞等成分，剩下纖維骨架及基膜組織，電鏡掃描下可以看到神經(jīng)細(xì)胞被萃取，剩下疏松的多孔的三維立體結(jié)構(gòu)支架。將此支架移植入體內(nèi)，20天后，相比于移植未萃取的組織對(duì)照組，萃取組可觀(guān)察到大量的微血管及神經(jīng)軸突通過(guò)損傷區(qū)，運(yùn)動(dòng)功能得到明顯改善。Hudson和Rovak等在隨后的嚙齒動(dòng)物模型上使用的大量的去細(xì)胞神經(jīng)異體組織移植的實(shí)驗(yàn)中證明其移植后幾乎不引起免疫排斥反應(yīng)[18，19]。Hu 等[20]采用去細(xì)胞處理同種異體神經(jīng)復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物長(zhǎng)節(jié)段尺神經(jīng)缺損，術(shù)后6個(gè)月，修復(fù)效果與自體移植相似。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中，常常因?yàn)橹袠袚p傷得不到有效的修復(fù)而造成永久的功能喪失。人工材料合成的支架由于降解物的毒副作用而讓研究者望而卻步，基于天然材料合成的支架也或多或少存在缺陷。Ribatti等[21]將SD大鼠腦組織去細(xì)胞處理后植入雞胚絨毛膜尿囊膜結(jié)果顯示能明顯促進(jìn)血管新生，并且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。脊髓細(xì)胞構(gòu)成和大腦相似，由此，此研究為去細(xì)胞組織支架修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供了理論支持。

Guo等[22]率先報(bào)道了去細(xì)胞脊髓組織支架的研究工作，采取Sondell萃取組織細(xì)胞方法并加以改進(jìn)，將脊髓組織凍融，再采用改良的化學(xué)萃取法制作去細(xì)胞脊髓組織支架。支架外觀(guān)結(jié)構(gòu)和正常脊髓形狀相似，呈半透明絨毛狀，組織支架內(nèi)神經(jīng)軸突及輔助細(xì)胞成功萃取掉，剩下高孔隙率的三維立體的疏松孔道狀結(jié)構(gòu)的支架，經(jīng)其測(cè)量空隙直徑為6-150 um，孔隙率高達(dá)90%以上，其平面結(jié)構(gòu)由不同大小的空隙縱向平行或不規(guī)則排列成孔道樣，并相互慣通，具有高度的仿真性，此結(jié)構(gòu)能為神經(jīng)軸突的再生提供天然的引導(dǎo)，再生的神經(jīng)從而可以有效的通過(guò)損傷區(qū)，達(dá)到尾端，為再生的神經(jīng)與尾端神經(jīng)組織的耦合提供了條件。該研究還提示去細(xì)胞脊髓組織支架具有良好的生物相容性，免疫原性極弱。通過(guò)同種異體組織支架移植的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，移植支架組未見(jiàn)免疫排斥反應(yīng)。該文章分析，免疫排斥反應(yīng)物質(zhì)主要來(lái)源于主要組織相容性抗原復(fù)合物（Major Histocompatibility Complex，MHC），其主要存在于細(xì)胞膜表面及神經(jīng)軸突的髓鞘成分，去細(xì)胞脊髓組織支架經(jīng)過(guò)萃取的過(guò)程，組織內(nèi)無(wú)細(xì)胞髓鞘等殘留。Liu等[23]做了更進(jìn)一步的研究，其采用去細(xì)胞脊髓組織支架復(fù)合人臍血干細(xì)胞修復(fù)SD大鼠脊髓損傷，取得了不錯(cuò)的效果。在該研究中，馬松三色染色結(jié)果顯示支架由主要成分為膠原。去細(xì)胞脊髓組織支架表現(xiàn)出較好的粘附力，細(xì)胞支架在體外聯(lián)合培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞可均勻分布在支架內(nèi)。移植入體內(nèi)后，三維立體結(jié)構(gòu)使部分種子細(xì)胞可以在組織及正常組織內(nèi)自由的遷移，種子細(xì)胞可分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞，并釋放促軸突再生的生長(zhǎng)因子，促進(jìn)軸突的再生，引導(dǎo)再生的軸突通過(guò)損傷區(qū)，與尾端組織相連。支架復(fù)合細(xì)胞移植入體內(nèi)還使鄰近損傷部位的受損神經(jīng)軸突的凋亡及軸突的髓鞘空泡化變減輕。該研究提示去細(xì)胞脊髓組織支架復(fù)合干細(xì)胞不僅可以促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生，還能保護(hù)鄰近損傷的神經(jīng)，達(dá)到了修復(fù)脊髓損傷，促進(jìn)功能的恢復(fù)。

近來(lái)，Zhang等[24]還嘗試采用肌肉組織去細(xì)胞支架來(lái)修復(fù)脊髓損傷，并取得一定的進(jìn)展。分析去細(xì)胞肌肉支架，構(gòu)成支架的膠原纖維的三維空間結(jié)構(gòu)與去細(xì)胞脊髓支架相似，該研究還顯示了去細(xì)胞肌肉組織支架的理化性質(zhì)和去細(xì)胞脊髓支架類(lèi)同，都具有良好地生物相容性及低免疫原性，較高的孔隙率及三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，生物降解率和脊髓修復(fù)時(shí)間相匹配等優(yōu)點(diǎn)。移植后8周可明顯觀(guān)察到大量的軸突長(zhǎng)入支架內(nèi)，并在支架的引導(dǎo)下通過(guò)損傷區(qū)，并獲得良好地功能恢復(fù)。相比于去細(xì)胞脊髓組織支架，去細(xì)胞組織支架還具有取材方便，可自體移植等優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，組織工程技術(shù)在移植材料、支架制備技術(shù)等方面的迅速發(fā)展已經(jīng)為脊髓損傷后神經(jīng)功能的修復(fù)展現(xiàn)了廣闊的前景，但仍然有些問(wèn)題未得到解決。人工材料合成的生物組織支架因其本身不可改變的屬性往往使其和細(xì)胞親和粘附性不佳、降解速率不確定及降解產(chǎn)物有毒、孔隙率及三維立體結(jié)構(gòu)很難把握而限制了其運(yùn)用，大有被天然生物材料取代的趨勢(shì)。天然的生物支架材料有較低的免疫原性，對(duì)細(xì)胞有較好的粘附力，還能包被目的生長(zhǎng)因子在支架內(nèi)，從而促進(jìn)種子細(xì)胞的存活時(shí)間，并促進(jìn)種子細(xì)胞的分化等優(yōu)勢(shì)，但天然生物材料的機(jī)械強(qiáng)度不高，降解率不能匹配組織再生修復(fù)的速率，而基于天然材料合成的支架又受限于制作工藝不高，較難按設(shè)想加工塑形的局限，很難達(dá)到理想支架的狀態(tài)，故還需要更多的研究來(lái)改進(jìn)。與之相較，將去細(xì)胞組織支架尤其是去細(xì)胞脊髓組織支架作為脊髓損傷修復(fù)的組織工程支架具有許多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：支架來(lái)源于天然組織，因此具備天然材料支架的屬性；其孔隙率及天然的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于種子細(xì)胞的存活及分化，并有利于軸突的再生長(zhǎng)，并引導(dǎo)軸突通過(guò)損傷區(qū)；其機(jī)械強(qiáng)度及生物支撐度和脊髓相似，能滿(mǎn)足損傷區(qū)的支撐需求。因此，去細(xì)胞組織支架是現(xiàn)階段修復(fù)脊髓損傷的最好選擇。神經(jīng)去細(xì)胞組織工程技術(shù)的發(fā)展復(fù)合日漸成熟的藥物緩釋技術(shù)，將推動(dòng)中樞神經(jīng)損傷的修復(fù)再上新臺(tái)階。

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