硝酸銀對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木薯遺傳轉(zhuǎn)化的影響

郭運(yùn)玲 尹奇 孔華 黃啟星 左嬌 賀立卡 郭安平

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101）

木薯（Manihot esculantaCrantz）屬大戟科（Euphorbiacae）木薯屬（Manihot），為多年生灌木，是世界三大薯類(lèi)作物之一。全球種植面積1 700余萬(wàn)hm2，僅次于馬鈴薯，大于甘薯，廣泛分布于南、北緯30之間，不僅為全球超過(guò)5億人提供基本的食物，而且是熱帶、亞熱帶重要的熱能來(lái)源［1］。由于木薯是雜合體，遺傳背景復(fù)雜，采用常規(guī)育種的方法改良品種和提高產(chǎn)量很難達(dá)到預(yù)期的效果。生物技術(shù)作為一種強(qiáng)有力的工具，能有效地彌補(bǔ)傳統(tǒng)育種方法的不足，打破物種間的界限，在不改變作物原有特性的基礎(chǔ)上，能將一些具有重要農(nóng)藝性狀的基因（如抗病、耐寒以及與產(chǎn)量、品質(zhì)相關(guān)基因等）導(dǎo)入其中，從而實(shí)現(xiàn)品種改良的目的。但是，許多植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究中存在的再生困難問(wèn)題嚴(yán)重制約了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用［2］。因此如何提高轉(zhuǎn)化效率是木薯及其他作物遺傳轉(zhuǎn)化中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。

硝酸銀曾作為一種殺菌劑，應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)的表面消毒［3］。近年來(lái)，在植物組織培養(yǎng)中，添加硝酸銀可以促進(jìn)愈傷組織及芽器官發(fā)生、體細(xì)胞胚胎的形成以及離體植株的再生，這在許多單子葉、雙子葉植物中已有研究［4］。有研究者將硝酸銀應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化上，以提高外源基因的轉(zhuǎn)化效率。例如，在水稻［5］、黑麥草［6］、油菜［7］，香蕉［3］，大豆［8］、桑樹(shù)［9］等作物的轉(zhuǎn)化研究中用到硝酸銀，結(jié)果顯示硝酸銀在這些作物的遺傳轉(zhuǎn)化中具有促進(jìn)作用。張鵬和姚慶榮［10，11］也對(duì)幾個(gè)木薯品種的器官發(fā)生和植株形成進(jìn)行過(guò)研究，發(fā)現(xiàn)硝酸銀有促進(jìn)芽器官的發(fā)生和抑制愈傷的形成。但是到目前為止，還沒(méi)有關(guān)于硝酸銀對(duì)木薯子葉經(jīng)農(nóng)桿菌處理后對(duì)不定芽誘導(dǎo)影響的報(bào)道。本研究以目前生產(chǎn)上的主栽木薯品種華南8號(hào)（SC8）胚狀體子葉為外植體，比較硝酸銀對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌侵染和未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的外植體的不定芽誘導(dǎo)的影響，研究硝酸銀在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木薯遺傳轉(zhuǎn)化中的作用，旨在為建立高效的木薯遺傳轉(zhuǎn)化體系打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為SC8，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所提供，本實(shí)驗(yàn)室試管苗保存。以成熟培養(yǎng)10-15 d的初生或次生胚狀體子葉作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)桿菌工程菌株及菌液的制備 農(nóng)桿菌工程菌株GV3101，內(nèi)含質(zhì)粒pRNAiSIII（本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存）。挑取保存的農(nóng)桿菌單菌落接種于25 mL含相應(yīng)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min培養(yǎng)24-36 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將培養(yǎng)好的菌液在5 000 r/min，常溫下離心10 min，收集菌體重懸于MS液體培養(yǎng)基中，使其菌液濃度達(dá)到OD=0.5-1.0備用。

1.2.2 培養(yǎng)基配置 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基上添加1 mg/L 6BA，0.5 mg/L CuSO4，2%蔗糖和6 g/L瓊脂粉，pH5.8。根據(jù)試驗(yàn)需要添加不同濃度的硝酸銀（0、2、4、6、8和 10 mg/L 6個(gè)處理）。

1.2.3 未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的硝酸銀作用試驗(yàn) 將準(zhǔn)備好的SC8胚狀體子葉接種在含不同濃度硝酸銀的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為28℃，光照12-14 h/d，光照強(qiáng)度1 500-2 000 Lx。7 d繼代一次，每皿接種50個(gè)外植體，每個(gè)處理接種3皿，重復(fù)2次。20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織和不定芽生長(zhǎng)情況。

1.2.4 經(jīng)農(nóng)桿菌處理后硝酸銀的作用試驗(yàn) 將準(zhǔn)備好的SC8胚狀體子葉放入制備好的農(nóng)桿菌工程菌液中侵染30-45 min，倒掉菌液，并將外植體上多余菌液吸干，接種到不加Kan的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d。然后將外植體上的菌體用無(wú)菌水沖洗2-3次，最后一次加入適量羧芐青霉素，直到將菌體全部洗凈，用無(wú)菌濾紙將外植體上多余水分吸干。接種到加有Kan抗性篩選和不同濃度硝酸銀的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。7 d繼代一次。每皿接種50個(gè)外植體，每處理接種3皿，重復(fù)2次。20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織和不定芽生長(zhǎng)情況。

1.2.5 硝酸銀處理時(shí)間對(duì)不定芽的影響試驗(yàn) 硝酸銀添加的時(shí)間設(shè)置兩個(gè)處理（A、B），A處理為20 d，即外植體在添加有硝酸銀的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)20 d后，其他培養(yǎng)條件不變，將外植體轉(zhuǎn)接到去除硝酸銀的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)7 d。B處理是在不定芽的誘導(dǎo)生長(zhǎng)整個(gè)過(guò)程中都添加硝酸銀。

1.2.6 外植體上不定芽和愈傷組織的統(tǒng)計(jì)方法 參考Zhang［10］2001年的方法并稍作修改。

不定芽的發(fā)生率分3個(gè)級(jí)別統(tǒng)計(jì)，分別用OD1（organogenesis degree）、OD2、OD3表示。OD1每個(gè)外植體上不定芽的分化為3個(gè)以下植株所占的百分比；OD2每個(gè)外植體上不定芽的分化為 3-5個(gè)植株所占的百分比；OD3 每個(gè)外植體上不定芽分化 5個(gè)以上植株所占的百分比；它們之和為每個(gè)處理的不定芽發(fā)生率SO（shoot organogenesis）。

愈傷組織的發(fā)生率也分3個(gè)級(jí)別統(tǒng)計(jì)，分別用CD1（callus degree）、CD2、CD3表示。CD1每個(gè)外植體上愈傷組織直徑小于0.25 cm植株所占的百分比；CD2每個(gè)外植體上愈傷組織直徑在0.25-0.5 cm植株所占的百分比；CD3愈傷組織直徑大于0.5 cm植株所占的百分比，它們之和為每個(gè)處理的愈傷組織發(fā)生率CF（callus formation）。

2 結(jié)果

2.1 硝酸銀對(duì)未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的木薯子葉愈傷及不定芽誘導(dǎo)的影響

由表1和表2及圖1可知，未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的木薯SC8胚狀體的子葉，由于硝酸銀濃度的不同，對(duì)外植體不定芽發(fā)生的影響不同。我們觀察到在不加硝酸銀的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，子葉切口處產(chǎn)生了大量黃色致密的愈傷組織，愈傷組織形成率達(dá)到100%；不定芽發(fā)生率較低，為 58.5%，主要以單芽分化為主。隨著硝酸銀濃度的增加，不定芽發(fā)生隨之增加，愈傷組織形成減少，當(dāng)濃度為6 mg/L時(shí)，不定芽發(fā)生率達(dá)到最高，為 87.5%，每個(gè)外植體上的不定芽數(shù)目也相應(yīng)增加，有些甚至達(dá)到6-7個(gè)。研究表明，添加適宜濃度的AgNO3，不僅可以大大提高不定芽的發(fā)生，而且可以明顯降低愈傷組織的形成。我們還可以看出，在不同濃度的硝酸銀處理中，愈傷組織形成隨AgNO3濃度的升高而降低，當(dāng)AgNO3濃度達(dá)到6 mg/L時(shí)，子葉切口周?chē)a(chǎn)生的愈傷較少；當(dāng)濃度大于6 mg/L，達(dá)到8和10 mg/L時(shí)，愈傷組織受到明顯抑制，幾乎沒(méi)有愈傷形成，但不定芽發(fā)生也未因此而升高，相反呈下降趨勢(shì)。因此，對(duì)木薯SC8而言，在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，添加6 mg/L硝酸銀，即可獲得最佳的不定芽誘導(dǎo)效果。

表1 不同濃度的硝酸銀對(duì)未經(jīng)農(nóng)桿菌處理外植體不定芽分化的影響

表2 不同濃度的硝酸銀對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌處理外植體愈傷組織形成的影響

圖1 硝酸銀對(duì)未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的SC8外植體不定芽誘導(dǎo)和愈傷組織形成的影響

2.2 硝酸銀對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌處理的木薯子葉愈傷及不定芽誘導(dǎo)的影響

由表3、表4和圖2可以看出，經(jīng)農(nóng)桿菌處理后的木薯SC8胚狀體子葉，我們觀察到在不加硝酸銀的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個(gè)子葉切口處都有淡黃色愈傷組織的形成，愈傷組織大有多；不定芽發(fā)生少，外植體上基本以單個(gè)芽分化為主。隨著硝酸銀濃度的增加，不定芽發(fā)生隨之增加，而愈傷組織反而減少。這與未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的研究結(jié)果大體一致。只是硝酸銀的濃度為8 mg/L時(shí)，不定芽發(fā)生率達(dá)到最高，為85.3%，每個(gè)外植體上的不定芽數(shù)目也有所增加，多的可達(dá)5個(gè)以上。當(dāng)硝酸銀濃度達(dá)到10 mg/L，愈傷組織基本很少，但不定芽的分化反而銳減，說(shuō)明硝酸銀的濃度并非越高越好，對(duì)木薯SC8而言，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后外植體不定芽的分化以添加硝酸銀濃度8 mg/L為適宜。

表3 不同濃度的硝酸銀對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌處理的外植體不定芽分化的影響

表4 不同濃度的硝酸銀對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌處理后外植體愈傷組織形成的影響

圖2 硝酸銀對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌處理的SC8外植體不定芽誘導(dǎo)和愈傷組織形成的影響

2.3 硝酸銀的處理時(shí)間對(duì)愈傷及不定芽的影響

圖3 硝酸銀處理時(shí)間對(duì)不定芽的影響

從圖3可以看出，處理A（20 d）誘導(dǎo)出來(lái)的不定芽生長(zhǎng)正常，處理B（全程）誘導(dǎo)出來(lái)的不定芽生長(zhǎng)不正常，芽發(fā)生畸形變異。所以，硝酸銀作為不定芽的促進(jìn)劑不能長(zhǎng)時(shí)間添加，添加的時(shí)間太長(zhǎng)，不但對(duì)芽的誘導(dǎo)沒(méi)有促進(jìn)作用，反而使誘導(dǎo)出的芽發(fā)生畸形變異。硝酸銀對(duì)木薯SC8子葉不定芽誘導(dǎo)的處理時(shí)間以20 d比較適宜。

3 討論

AgNO3作為乙烯合成抑制劑，可有效降低植物細(xì)胞在離體培養(yǎng)中乙烯的積累，從而促進(jìn)外植體的生長(zhǎng)和不定芽分化。在植物離體培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中添加AgNO3，可以明顯促進(jìn)器官發(fā)生、體細(xì)胞胚胎形成和完整植株的再生。在許多單子葉和雙子葉作物上得到證明和應(yīng)用［12-15］。

許多研究在建立植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系時(shí)都對(duì)培養(yǎng)基上添加硝酸銀的最適濃度進(jìn)行篩選［10，11］，但是這種篩選一般是在外植體未被農(nóng)桿菌處理的情況下進(jìn)行的，當(dāng)外植體被農(nóng)桿菌處理后受到的脅迫增加，外植體內(nèi)的乙烯含量從理論上來(lái)說(shuō)也會(huì)相應(yīng)增加，那么在后期的篩選培養(yǎng)基上所加硝酸銀濃度是否會(huì)隨之發(fā)生變化，而且硝酸銀對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到底有無(wú)影響，這一問(wèn)題往往被忽視。本研究從該問(wèn)題著手，比較研究了硝酸銀對(duì)未經(jīng)農(nóng)桿菌處理和經(jīng)農(nóng)桿菌處理后的木薯子葉不定芽誘導(dǎo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硝酸銀對(duì)二者的影響基本一致，只是經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后所需硝酸銀的最適濃度為8 mg/L，高于未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的芽誘導(dǎo)所需硝酸銀最適濃度6 mg/L。這可能與外植體所受的脅迫不同有關(guān)，經(jīng)農(nóng)桿菌處理過(guò)的外植體所受脅迫不但有機(jī)械損傷，還有農(nóng)桿菌的侵染、篩選抗性標(biāo)記卡納霉素和抑菌劑羧芐青霉素的影響，需要更多的銀離子來(lái)抑制乙烯的作用。

硝酸銀添加的濃度、方式及時(shí)間，從其他作物的研究結(jié)果來(lái)看，硝酸銀使用的濃度一般是1-10 mg/L。濃度太高，對(duì)外植體會(huì)產(chǎn)生毒性作用［4］。同時(shí)應(yīng)注意適宜的AgNO3濃度，外植體長(zhǎng)期培養(yǎng)于含AgNO3的培養(yǎng)基中也易導(dǎo)致再生植物畸形而影響再生率。Palmer［16］將培養(yǎng)12 d的外植體轉(zhuǎn)接到不含硝酸銀的培養(yǎng)基上，能促進(jìn)不定芽的數(shù)目。Sharma等［17］認(rèn)為，培養(yǎng)物最少應(yīng)在含硝酸銀的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)11 d，張鵬［12，13］認(rèn)為硝酸銀使用時(shí)間長(zhǎng)短跟芽原基的形成時(shí)間有關(guān)，一般在芽原基形成后即可去除硝酸銀，不同植物不同品種對(duì)硝酸銀的反應(yīng)不同。與前人研究結(jié)果相同，木薯SC8子葉芽的誘導(dǎo)和形成不能在添加硝酸銀的培養(yǎng)基上長(zhǎng)期生長(zhǎng)，以在添加硝酸銀芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)20 d較適宜，這時(shí)能有效促進(jìn)芽的分化和生長(zhǎng)。若時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)不定芽的形成沒(méi)有促進(jìn)作用，反而會(huì)使已形成的芽發(fā)生畸形變異而影響再生率。

4 結(jié)論

本研究以成熟培養(yǎng)10-15 d華南木薯SC8品種的胚狀體子葉為外植體，研究硝酸銀在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木薯遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，硝酸銀對(duì)木薯SC8胚狀體子葉愈傷形成有明顯抑制作用，對(duì)其遺傳轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用。

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