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    硝酸銀對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木薯遺傳轉(zhuǎn)化的影響

    2013-01-16 08:52:30郭運(yùn)玲尹奇孔華黃啟星左嬌賀立卡郭安平
    生物技術(shù)通報(bào) 2013年3期
    關(guān)鍵詞:硝酸銀子葉木薯

    郭運(yùn)玲 尹奇 孔華 黃啟星 左嬌 賀立卡 郭安平

    (中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海口 571101)

    木薯(Manihot esculantaCrantz)屬大戟科(Euphorbiacae)木薯屬(Manihot),為多年生灌木,是世界三大薯類(lèi)作物之一。全球種植面積1 700余萬(wàn)hm2,僅次于馬鈴薯,大于甘薯,廣泛分布于南、北緯30之間,不僅為全球超過(guò)5億人提供基本的食物,而且是熱帶、亞熱帶重要的熱能來(lái)源[1]。由于木薯是雜合體,遺傳背景復(fù)雜,采用常規(guī)育種的方法改良品種和提高產(chǎn)量很難達(dá)到預(yù)期的效果。生物技術(shù)作為一種強(qiáng)有力的工具,能有效地彌補(bǔ)傳統(tǒng)育種方法的不足,打破物種間的界限,在不改變作物原有特性的基礎(chǔ)上,能將一些具有重要農(nóng)藝性狀的基因(如抗病、耐寒以及與產(chǎn)量、品質(zhì)相關(guān)基因等)導(dǎo)入其中,從而實(shí)現(xiàn)品種改良的目的。但是,許多植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究中存在的再生困難問(wèn)題嚴(yán)重制約了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用[2]。因此如何提高轉(zhuǎn)化效率是木薯及其他作物遺傳轉(zhuǎn)化中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。

    硝酸銀曾作為一種殺菌劑,應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)的表面消毒[3]。近年來(lái),在植物組織培養(yǎng)中,添加硝酸銀可以促進(jìn)愈傷組織及芽器官發(fā)生、體細(xì)胞胚胎的形成以及離體植株的再生,這在許多單子葉、雙子葉植物中已有研究[4]。有研究者將硝酸銀應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化上,以提高外源基因的轉(zhuǎn)化效率。例如,在水稻[5]、黑麥草[6]、油菜[7],香蕉[3],大豆[8]、桑樹(shù)[9]等作物的轉(zhuǎn)化研究中用到硝酸銀,結(jié)果顯示硝酸銀在這些作物的遺傳轉(zhuǎn)化中具有促進(jìn)作用。張鵬和姚慶榮[10,11]也對(duì)幾個(gè)木薯品種的器官發(fā)生和植株形成進(jìn)行過(guò)研究,發(fā)現(xiàn)硝酸銀有促進(jìn)芽器官的發(fā)生和抑制愈傷的形成。但是到目前為止,還沒(méi)有關(guān)于硝酸銀對(duì)木薯子葉經(jīng)農(nóng)桿菌處理后對(duì)不定芽誘導(dǎo)影響的報(bào)道。本研究以目前生產(chǎn)上的主栽木薯品種華南8號(hào)(SC8)胚狀體子葉為外植體,比較硝酸銀對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌侵染和未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的外植體的不定芽誘導(dǎo)的影響,研究硝酸銀在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木薯遺傳轉(zhuǎn)化中的作用,旨在為建立高效的木薯遺傳轉(zhuǎn)化體系打下基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試材料為SC8,由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所提供,本實(shí)驗(yàn)室試管苗保存。以成熟培養(yǎng)10-15 d的初生或次生胚狀體子葉作為外植體。

    1.2 方法

    1.2.1 農(nóng)桿菌工程菌株及菌液的制備 農(nóng)桿菌工程菌株GV3101,內(nèi)含質(zhì)粒pRNAiSIII(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存)。挑取保存的農(nóng)桿菌單菌落接種于25 mL含相應(yīng)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中,28℃,200 r/min培養(yǎng)24-36 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,將培養(yǎng)好的菌液在5 000 r/min,常溫下離心10 min,收集菌體重懸于MS液體培養(yǎng)基中,使其菌液濃度達(dá)到OD=0.5-1.0備用。

    1.2.2 培養(yǎng)基配置 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基上添加1 mg/L 6BA,0.5 mg/L CuSO4,2%蔗糖和6 g/L瓊脂粉,pH5.8。根據(jù)試驗(yàn)需要添加不同濃度的硝酸銀(0、2、4、6、8和 10 mg/L 6個(gè)處理)。

    1.2.3 未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的硝酸銀作用試驗(yàn) 將準(zhǔn)備好的SC8胚狀體子葉接種在含不同濃度硝酸銀的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為28℃,光照12-14 h/d,光照強(qiáng)度1 500-2 000 Lx。7 d繼代一次,每皿接種50個(gè)外植體,每個(gè)處理接種3皿,重復(fù)2次。20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織和不定芽生長(zhǎng)情況。

    1.2.4 經(jīng)農(nóng)桿菌處理后硝酸銀的作用試驗(yàn) 將準(zhǔn)備好的SC8胚狀體子葉放入制備好的農(nóng)桿菌工程菌液中侵染30-45 min,倒掉菌液,并將外植體上多余菌液吸干,接種到不加Kan的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d。然后將外植體上的菌體用無(wú)菌水沖洗2-3次,最后一次加入適量羧芐青霉素,直到將菌體全部洗凈,用無(wú)菌濾紙將外植體上多余水分吸干。接種到加有Kan抗性篩選和不同濃度硝酸銀的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。7 d繼代一次。每皿接種50個(gè)外植體,每處理接種3皿,重復(fù)2次。20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織和不定芽生長(zhǎng)情況。

    1.2.5 硝酸銀處理時(shí)間對(duì)不定芽的影響試驗(yàn) 硝酸銀添加的時(shí)間設(shè)置兩個(gè)處理(A、B),A處理為20 d,即外植體在添加有硝酸銀的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)20 d后,其他培養(yǎng)條件不變,將外植體轉(zhuǎn)接到去除硝酸銀的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)7 d。B處理是在不定芽的誘導(dǎo)生長(zhǎng)整個(gè)過(guò)程中都添加硝酸銀。

    1.2.6 外植體上不定芽和愈傷組織的統(tǒng)計(jì)方法 參考Zhang[10]2001年的方法并稍作修改。

    不定芽的發(fā)生率分3個(gè)級(jí)別統(tǒng)計(jì),分別用OD1(organogenesis degree)、OD2、OD3表示。OD1每個(gè)外植體上不定芽的分化為3個(gè)以下植株所占的百分比;OD2每個(gè)外植體上不定芽的分化為 3-5個(gè)植株所占的百分比;OD3 每個(gè)外植體上不定芽分化 5個(gè)以上植株所占的百分比;它們之和為每個(gè)處理的不定芽發(fā)生率SO(shoot organogenesis)。

    愈傷組織的發(fā)生率也分3個(gè)級(jí)別統(tǒng)計(jì),分別用CD1(callus degree)、CD2、CD3表示。CD1每個(gè)外植體上愈傷組織直徑小于0.25 cm植株所占的百分比;CD2每個(gè)外植體上愈傷組織直徑在0.25-0.5 cm植株所占的百分比;CD3愈傷組織直徑大于0.5 cm植株所占的百分比,它們之和為每個(gè)處理的愈傷組織發(fā)生率CF(callus formation)。

    2 結(jié)果

    2.1 硝酸銀對(duì)未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的木薯子葉愈傷及不定芽誘導(dǎo)的影響

    由表1和表2及圖1可知,未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的木薯SC8胚狀體的子葉,由于硝酸銀濃度的不同,對(duì)外植體不定芽發(fā)生的影響不同。我們觀察到在不加硝酸銀的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,子葉切口處產(chǎn)生了大量黃色致密的愈傷組織,愈傷組織形成率達(dá)到100%;不定芽發(fā)生率較低,為 58.5%,主要以單芽分化為主。隨著硝酸銀濃度的增加,不定芽發(fā)生隨之增加,愈傷組織形成減少,當(dāng)濃度為6 mg/L時(shí),不定芽發(fā)生率達(dá)到最高,為 87.5%,每個(gè)外植體上的不定芽數(shù)目也相應(yīng)增加,有些甚至達(dá)到6-7個(gè)。研究表明,添加適宜濃度的AgNO3,不僅可以大大提高不定芽的發(fā)生,而且可以明顯降低愈傷組織的形成。我們還可以看出,在不同濃度的硝酸銀處理中,愈傷組織形成隨AgNO3濃度的升高而降低,當(dāng)AgNO3濃度達(dá)到6 mg/L時(shí),子葉切口周?chē)a(chǎn)生的愈傷較少;當(dāng)濃度大于6 mg/L,達(dá)到8和10 mg/L時(shí),愈傷組織受到明顯抑制,幾乎沒(méi)有愈傷形成,但不定芽發(fā)生也未因此而升高,相反呈下降趨勢(shì)。因此,對(duì)木薯SC8而言,在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,添加6 mg/L硝酸銀,即可獲得最佳的不定芽誘導(dǎo)效果。

    表1 不同濃度的硝酸銀對(duì)未經(jīng)農(nóng)桿菌處理外植體不定芽分化的影響

    表2 不同濃度的硝酸銀對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌處理外植體愈傷組織形成的影響

    圖1 硝酸銀對(duì)未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的SC8外植體不定芽誘導(dǎo)和愈傷組織形成的影響

    2.2 硝酸銀對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌處理的木薯子葉愈傷及不定芽誘導(dǎo)的影響

    由表3、表4和圖2可以看出,經(jīng)農(nóng)桿菌處理后的木薯SC8胚狀體子葉,我們觀察到在不加硝酸銀的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,每個(gè)子葉切口處都有淡黃色愈傷組織的形成,愈傷組織大有多;不定芽發(fā)生少,外植體上基本以單個(gè)芽分化為主。隨著硝酸銀濃度的增加,不定芽發(fā)生隨之增加,而愈傷組織反而減少。這與未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的研究結(jié)果大體一致。只是硝酸銀的濃度為8 mg/L時(shí),不定芽發(fā)生率達(dá)到最高,為85.3%,每個(gè)外植體上的不定芽數(shù)目也有所增加,多的可達(dá)5個(gè)以上。當(dāng)硝酸銀濃度達(dá)到10 mg/L,愈傷組織基本很少,但不定芽的分化反而銳減,說(shuō)明硝酸銀的濃度并非越高越好,對(duì)木薯SC8而言,經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后外植體不定芽的分化以添加硝酸銀濃度8 mg/L為適宜。

    表3 不同濃度的硝酸銀對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌處理的外植體不定芽分化的影響

    表4 不同濃度的硝酸銀對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌處理后外植體愈傷組織形成的影響

    圖2 硝酸銀對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌處理的SC8外植體不定芽誘導(dǎo)和愈傷組織形成的影響

    2.3 硝酸銀的處理時(shí)間對(duì)愈傷及不定芽的影響

    圖3 硝酸銀處理時(shí)間對(duì)不定芽的影響

    從圖3可以看出,處理A(20 d)誘導(dǎo)出來(lái)的不定芽生長(zhǎng)正常,處理B(全程)誘導(dǎo)出來(lái)的不定芽生長(zhǎng)不正常,芽發(fā)生畸形變異。所以,硝酸銀作為不定芽的促進(jìn)劑不能長(zhǎng)時(shí)間添加,添加的時(shí)間太長(zhǎng),不但對(duì)芽的誘導(dǎo)沒(méi)有促進(jìn)作用,反而使誘導(dǎo)出的芽發(fā)生畸形變異。硝酸銀對(duì)木薯SC8子葉不定芽誘導(dǎo)的處理時(shí)間以20 d比較適宜。

    3 討論

    AgNO3作為乙烯合成抑制劑,可有效降低植物細(xì)胞在離體培養(yǎng)中乙烯的積累,從而促進(jìn)外植體的生長(zhǎng)和不定芽分化。在植物離體培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)基中添加AgNO3,可以明顯促進(jìn)器官發(fā)生、體細(xì)胞胚胎形成和完整植株的再生。在許多單子葉和雙子葉作物上得到證明和應(yīng)用[12-15]。

    許多研究在建立植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系時(shí)都對(duì)培養(yǎng)基上添加硝酸銀的最適濃度進(jìn)行篩選[10,11],但是這種篩選一般是在外植體未被農(nóng)桿菌處理的情況下進(jìn)行的,當(dāng)外植體被農(nóng)桿菌處理后受到的脅迫增加,外植體內(nèi)的乙烯含量從理論上來(lái)說(shuō)也會(huì)相應(yīng)增加,那么在后期的篩選培養(yǎng)基上所加硝酸銀濃度是否會(huì)隨之發(fā)生變化,而且硝酸銀對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到底有無(wú)影響,這一問(wèn)題往往被忽視。本研究從該問(wèn)題著手,比較研究了硝酸銀對(duì)未經(jīng)農(nóng)桿菌處理和經(jīng)農(nóng)桿菌處理后的木薯子葉不定芽誘導(dǎo)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)硝酸銀對(duì)二者的影響基本一致,只是經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后所需硝酸銀的最適濃度為8 mg/L,高于未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的芽誘導(dǎo)所需硝酸銀最適濃度6 mg/L。這可能與外植體所受的脅迫不同有關(guān),經(jīng)農(nóng)桿菌處理過(guò)的外植體所受脅迫不但有機(jī)械損傷,還有農(nóng)桿菌的侵染、篩選抗性標(biāo)記卡納霉素和抑菌劑羧芐青霉素的影響,需要更多的銀離子來(lái)抑制乙烯的作用。

    硝酸銀添加的濃度、方式及時(shí)間,從其他作物的研究結(jié)果來(lái)看,硝酸銀使用的濃度一般是1-10 mg/L。濃度太高,對(duì)外植體會(huì)產(chǎn)生毒性作用[4]。同時(shí)應(yīng)注意適宜的AgNO3濃度,外植體長(zhǎng)期培養(yǎng)于含AgNO3的培養(yǎng)基中也易導(dǎo)致再生植物畸形而影響再生率。Palmer[16]將培養(yǎng)12 d的外植體轉(zhuǎn)接到不含硝酸銀的培養(yǎng)基上,能促進(jìn)不定芽的數(shù)目。Sharma等[17]認(rèn)為,培養(yǎng)物最少應(yīng)在含硝酸銀的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)11 d,張鵬[12,13]認(rèn)為硝酸銀使用時(shí)間長(zhǎng)短跟芽原基的形成時(shí)間有關(guān),一般在芽原基形成后即可去除硝酸銀,不同植物不同品種對(duì)硝酸銀的反應(yīng)不同。與前人研究結(jié)果相同,木薯SC8子葉芽的誘導(dǎo)和形成不能在添加硝酸銀的培養(yǎng)基上長(zhǎng)期生長(zhǎng),以在添加硝酸銀芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)20 d較適宜,這時(shí)能有效促進(jìn)芽的分化和生長(zhǎng)。若時(shí)間過(guò)長(zhǎng),對(duì)不定芽的形成沒(méi)有促進(jìn)作用,反而會(huì)使已形成的芽發(fā)生畸形變異而影響再生率。

    4 結(jié)論

    本研究以成熟培養(yǎng)10-15 d華南木薯SC8品種的胚狀體子葉為外植體,研究硝酸銀在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木薯遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明,硝酸銀對(duì)木薯SC8胚狀體子葉愈傷形成有明顯抑制作用,對(duì)其遺傳轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用。

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